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[交流]
連接、轉(zhuǎn)化以及酶切問題
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| 各位師兄師姐好，我是新手，請教師兄師姐一些問題：我的目的基因分別是1938和894bp，我擴全長，用的DNAMAN設(shè)計的反義引物，分別都加有SacI和Xbal酶切位點以及保護堿基，擴出來的膠回收分別連接到T1-simple載體上做轉(zhuǎn)化，感受態(tài)用的是全式金的，藍白斑篩選出白斑和藍斑做的菌液PCR沒有問題，搖菌提的質(zhì)粒，然后酶切，用的質(zhì)粒模板16ul，酶各1ul，37°反應(yīng)2小時45分鐘，只有894bp的那個能切下來，但是和之前的菌液PCR跑電泳作對比要低一點點；1938bp的那個基因一直切不下來，我又把模板量稀釋了一下，能切動，但是和菌液PCR產(chǎn)物對比要高一點點，很糾結(jié)啊，都做了2個月了，不是擴不出來就是切不下來，我的質(zhì)粒PCR和菌液PCR以及894bp的酶切產(chǎn)物目的基因膠回收做的PCR均沒有問題，請求各位師兄師姐多多指教啊~~~謝謝~~~ |
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