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fangmeizh

銅蟲 (初入文壇)

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[求助] SYBR green表達，擴增效率

用SYBR green相對定量，自己用5個梯度做標準曲線，目的基因的擴增效率只有87%，內(nèi)參基因有92%，這兩對引物可以做定量表達分析嗎？

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做好自己

1樓 2014-05-03 16:59:39

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kellytan001

銀蟲 (小有名氣)

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【答案】應(yīng)助回帖

熒光定量PCR分析基因表達有兩種方法：1、是標準品法。這種方法要求有已經(jīng)知道的拷貝數(shù)。不需要內(nèi)參。不同拷貝數(shù)得到不同ct值。做出方程計算未知樣品的拷貝數(shù)。2、是相對內(nèi)參方法。這種方法要求內(nèi)參，并且每組要分別對應(yīng)內(nèi)參，分析數(shù)據(jù)時將內(nèi)參減去。不需要標準品。樓主說的標準曲線應(yīng)該是這樣理解的：對于PCR擴增，無法達到100%。所以為了保證反應(yīng)體系具備很好的擴增效率（重點取決于引物的好壞），我們就嘗試做標準曲線檢測反應(yīng)體系的擴增效率。delta delta統(tǒng)計方法的使用要求擴增效率達到95%-105%之間。3、擴增效率的做法：就是用任意一組的cDNA進行10濃度稀釋，加入引物。一般為5-7個梯度，每個梯度為4個副孔。完成后pcr儀器會給你一個曲線和方程。求出斜率計算出擴增效率，嚴格上講如果不在95%-105%之間是需要換引物的。

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回復(fù)此樓

奮斗無極限

2樓2014-05-04 12:20:04

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