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藍(lán)老虎317銀蟲 (初入文壇)
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[求助]
求助�。�！質(zhì)粒轉(zhuǎn)化一直不成功 已有13人參與
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最近質(zhì)粒轉(zhuǎn)化。是用BL21-DE3做表達(dá)。 有一次是一個(gè)師兄帶著做，這里操作說明一下：（1）取1ul的質(zhì)粒，然后用100ul的槍將感受態(tài)吸出來，打入含有1ul的tube中，吹打三四次，放半小時(shí)，(2)熱激60s，(3)冰上放2min,(4)直接涂板（備注：這里涂布棒都是酒精燈燒過晾干的），過夜，結(jié)果長(zhǎng)不出菌落。 前兩次是自己做， 步驟大體相類似：(1)我直接將1ul的質(zhì)粒加入到感受態(tài)的tube中（稍融化），沒有吹打，只是用槍在感受態(tài)中旋轉(zhuǎn)了四五圈，放半小時(shí)（2）熱激90s，（3）冰上放2min，（4）加不含抗性LB 900ul到tube中，170r/min，1小時(shí)；（5）離心12000rp 1min ，去上清液900ul，剩下100ul吹打混勻；（6）涂板，過夜。 這里我和師兄的操作有些許區(qū)別： 1、很多同學(xué)覺得不加LB搖菌的話，菌可能含量太少，那是不是一定要搖呢？ 2、師兄之所以不搖，是因?yàn)橹白隽硪粋�(gè)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的時(shí)候，直接涂，的確長(zhǎng)出了單克隆菌。 現(xiàn)在經(jīng)過好幾次的折騰，就是一個(gè)菌不長(zhǎng)。感受態(tài)（借給其他組同學(xué)，她加自己的其他10ul質(zhì)粒，其余步驟和我一樣，長(zhǎng)出了單克隆菌），抗性（自己用的卡納和氨芐在其他菌表達(dá)的時(shí)候都是有效的），質(zhì)粒質(zhì)量（老板保證說質(zhì)粒是沒有問題的），可是依然沒能長(zhǎng)出單克隆菌。 我想問一下還有哪些可能的因素影響質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化。 謝謝各位了��！ |
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藍(lán)老虎317
銀蟲 (初入文壇)
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3樓2014-05-06 12:22:49
【答案】應(yīng)助回帖
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感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
藍(lán)老虎317(西門吹雪170代發(fā)): 金幣+2, 鼓勵(lì)回帖交流 2014-05-06 12:19:32
感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
藍(lán)老虎317(西門吹雪170代發(fā)): 金幣+2, 鼓勵(lì)回帖交流 2014-05-06 12:19:32
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檢查感受態(tài)、平板會(huì)不會(huì)有問題。 你們實(shí)驗(yàn)室制作感受態(tài)看起來不是很好啊，去買商業(yè)化的感受態(tài)吧，不貴。 我們自己制作的感受態(tài)，質(zhì)粒0.2ul+100ul感受態(tài)，涂板20ul，就能長(zhǎng)很多。質(zhì)粒直接轉(zhuǎn)化，我們都不加無抗生素的培養(yǎng)液搖，也不會(huì)全部涂板，怕長(zhǎng)的太滿。 長(zhǎng)沙感受態(tài)，10塊錢100ul，需要的聯(lián)系我。 |
2樓2014-05-06 12:17:10
4樓2014-05-06 12:26:52
sakor
鐵蟲 (初入文壇)
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5樓2014-05-06 12:29:35
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