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北京石油化工學(xué)院2026年研究生招生接收調(diào)劑公告

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fistwl

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[求助] 我的RT-CR有什么問(wèn)題已有2人參與

上普通的PCR驗(yàn)證過(guò)引物，一個(gè)是GAP，一個(gè)是ALP，片段都是200bp，都沒(méi)有問(wèn)題，可以P出來(lái)。但是一上RT-PCR就不行了，實(shí)驗(yàn)組的GAP和ALP的Ct值是5左右，直接在第四個(gè)循環(huán)的時(shí)候，就已經(jīng)飆上去了，對(duì)照組的GAP也不行，Ct值也很低，就只有對(duì)照組的ALP的Ct值相對(duì)正常一些，在23左右，求問(wèn)是什么原因，我已經(jīng)做了六遍了，排除了加樣問(wèn)題，孔污染問(wèn)題，引物質(zhì)量問(wèn)題等等。
PS，我的cDNA是用6ug的RNA反轉(zhuǎn)錄的，不知道是不是因?yàn)檫@個(gè)問(wèn)題，反轉(zhuǎn)錄酶是TAKARA的，RT-PCR的SYBR是Bio-rad的

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1樓 2014-05-08 14:33:14

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gyesang

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fistwl(西門(mén)吹雪170代發(fā)): 金幣+1, 鼓勵(lì)回帖交流 2014-05-08 19:16:26

“實(shí)驗(yàn)組的GAP和ALP的Ct值是5左右，直接在第四個(gè)循環(huán)的時(shí)候，就已經(jīng)飆上去”
“我的cDNA是用6ug的RNA反轉(zhuǎn)錄的”
明顯是你的RNA(cDNA)模板量太大了，我們都是用1ug RNA做逆轉(zhuǎn)錄然后做的，如果是6ug，把你cDNA稀釋1000倍后再做

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2樓2014-05-08 14:46:26

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junnavme2014

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gyesang: 金幣+2, 鼓勵(lì)回帖交流！ 2014-05-08 21:52:32

把模板稀釋5-10倍以后再用，如果還早了再稀釋，一般控制在18-25課循環(huán)出峰為好

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3樓2014-05-08 19:53:14

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我昨天晚上做了一個(gè)稀釋十倍和稀釋50倍的，結(jié)果更詭異，直接4個(gè)循環(huán)熒光值又飆到10去了，我的心已經(jīng)死了，打算等隔壁實(shí)驗(yàn)室的師兄回來(lái)給我做一次

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4樓2014-05-09 09:04:24

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