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Elisa檢測樣本中蛋白的含量，標(biāo)曲線性范圍和樣本最佳稀釋倍數(shù)怎么確定？ 已有2人參與
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采用別人推薦的國外的Elisa試劑盒，本來是定性的試劑盒，只有陽性對照品，陽性對照倍比稀釋后線性很好，我們就考慮用來做定量檢測。該試劑盒用的是雙抗體夾心法。現(xiàn)在遇到了以下兩個問題，想請各位幫忙支支招。 1.關(guān)于標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍：陽性對照品的單位為ng/mL單位，本來含量就很少，倍比稀釋了好多濃度，標(biāo)曲用線性擬合，線性依然非常好，R2=0.999以上，那么我要怎么確定這個試劑盒的檢測下限或定量下限（因?yàn)槲业臉颖局斜緛砗靠赡芫秃芪⒘�，低濃度的檢測比較有用） 2.關(guān)于樣本的最佳稀釋倍數(shù)：我要檢測的是一種外源蛋白，不是抗體類蛋白。這種蛋白從理論上是幾乎不太可能在血清中存在，但我要Elisa檢測確定下這種蛋白是否進(jìn)入血清。由于沒有陽性血清，目前測得的血清中含量都很微量，但由于還沒摸索出最佳稀釋倍數(shù)，請教各位有什么好方法可以確定其最佳稀釋倍數(shù)。聽老師說以血清為基質(zhì)加入含這種蛋白的溶液進(jìn)行稀釋，我還是不太懂該怎么操作，親們有經(jīng)驗(yàn)的多指教指教啊。那么其他樣本的最佳稀釋倍數(shù)又是怎么確定的呢？ |
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youlinglyw: 金幣+5, BioEPI+1, 贈人玫瑰手有余香，生物科學(xué)有你更精彩！ 2014-06-07 09:10:58
youlinglyw: 金幣+5, BioEPI+1, 贈人玫瑰手有余香，生物科學(xué)有你更精彩！ 2014-06-07 09:10:58
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我來嘗試回答一下樓主的問題。 第一個問題，標(biāo)準(zhǔn)曲線的范圍。對于標(biāo)準(zhǔn)曲線的最低檢出量，其實(shí)有至少兩種方法可以確定的。第一，理論上的最低檢出量，這個可以通過計算來確定，這是夾心法，將陰性對照的OD值+2SD（陰性對照OD值的標(biāo)準(zhǔn)差），計算出來的OD值代入擬合出來的標(biāo)準(zhǔn)曲線，就是理論上的最低檢出限；第二，將陽性對照用陰性對照進(jìn)行對倍稀釋，稀釋N次之后，每個稀釋度做10個復(fù)孔，計算每個稀釋度10個復(fù)孔OD值的精密性（CV%值），如果再第N次稀釋的CV%大于15%，則第N-1次稀釋時的濃度，就是最低檢出限。其他的方法，我也不太清楚了，但如果是作為標(biāo)準(zhǔn)曲線的第二個點(diǎn)的濃度（即零濃度之后的第一個濃度點(diǎn)），建議可能的話，就用cutoff值（臨界值）作為其濃度。 第二個問題，血樣的最佳稀釋度。這個要根據(jù)血樣里，待測物質(zhì)的濃度來決定，如果待測物質(zhì)的濃度在標(biāo)準(zhǔn)曲線的濃度范圍里的話，血樣不用稀釋都可以，如果待測物質(zhì)的濃度超出了標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性范圍，則把血樣稀釋至線性范圍內(nèi)就行了。 補(bǔ)充一下，以血清為基質(zhì)，把待測物質(zhì)按一定的濃度加入到血清里，進(jìn)行檢測。我覺得這是測定試劑的回收率，是判斷試劑準(zhǔn)確度的標(biāo)準(zhǔn)之一，是定量試劑準(zhǔn)確性評價的一種重要方法。 |
3樓2014-06-06 21:05:08
2樓2014-05-23 00:27:22
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