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love犬夜叉木蟲 (小有名氣)
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[求助]
測序結(jié)果引物部分跟原本應(yīng)該的序列相比少個堿基，是引物的問題還是連接過程中丟失？ 已有1人參與
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| 我一段基因序列在一頭一尾各加上一個酶切位點，然后設(shè)計的引物做PCR，然后連接到19T載體后測序，兩次測序結(jié)果都顯示在尾部的酶切識別位點少一個T堿基，請問下這是因為引物在合成時就少了一個T，還是在PCR過程中丟失了一個T？我還要繼續(xù)做下去么？（酶切下來練到表達(dá)載體上？）還是重新做一次PCR，再連接測序？ |
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【答案】應(yīng)助回帖
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感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
love犬夜叉(西門吹雪170代發(fā)): 金幣+3, 鼓勵回帖交流 2014-05-24 22:52:51
感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
love犬夜叉(西門吹雪170代發(fā)): 金幣+3, 鼓勵回帖交流 2014-05-24 22:52:51
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酶切，能切下來就是正確的。測序數(shù)據(jù)前面20個左右的堿基和800以后的堿基可信度不是太高，如果出錯在這些區(qū)域重新選擇測序引物。 PS： Sanger法測序，在測序反應(yīng)結(jié)束后，需要進(jìn)行乙醇純化的步驟，一般30bp以內(nèi)的小片段會丟失，所以所得測序數(shù)據(jù)的起始堿基是測序引物后30bp以外的序列。當(dāng)用PCR引物作為測序引物時，測序結(jié)果中是不包含引物序列的。若希望得到引物序列，可通過以下兩種方法：① 對于長度<800bp的PCR產(chǎn)物，可用另一端的引物進(jìn)行測序，所得序列的末端就包含引物的反向互補序列。② 對于較長的序列，一個測序反應(yīng)無法測通，可通過將PCR產(chǎn)物片段克隆到適當(dāng)?shù)妮d體，用載體上的通用引物進(jìn)行測序。由于載體上的通用引物與插入序列之間還有一段距離，因此可以獲得完整的PCR引物序列。另外，測序起始端的堿基容易發(fā)生誤讀，若您希望獲得PCR產(chǎn)物的完整序列，建議克隆后再測序。 |
2樓2014-05-23 08:39:07
love犬夜叉
木蟲 (小有名氣)
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3樓2014-05-24 16:23:41
4樓2014-05-24 19:01:12
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