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love犬夜叉木蟲 (小有名氣)
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[求助]
測(cè)序結(jié)果引物部分跟原本應(yīng)該的序列相比少個(gè)堿基，是引物的問(wèn)題還是連接過(guò)程中丟失？ 已有1人參與
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| 我一段基因序列在一頭一尾各加上一個(gè)酶切位點(diǎn)，然后設(shè)計(jì)的引物做PCR，然后連接到19T載體后測(cè)序，兩次測(cè)序結(jié)果都顯示在尾部的酶切識(shí)別位點(diǎn)少一個(gè)T堿基，請(qǐng)問(wèn)下這是因?yàn)橐镌诤铣蓵r(shí)就少了一個(gè)T，還是在PCR過(guò)程中丟失了一個(gè)T？我還要繼續(xù)做下去么？（酶切下來(lái)練到表達(dá)載體上？）還是重新做一次PCR，再連接測(cè)序？ |
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【答案】應(yīng)助回帖
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感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
love犬夜叉(西門吹雪170代發(fā)): 金幣+3, 鼓勵(lì)回帖交流 2014-05-24 22:52:51
感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
love犬夜叉(西門吹雪170代發(fā)): 金幣+3, 鼓勵(lì)回帖交流 2014-05-24 22:52:51
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酶切，能切下來(lái)就是正確的。測(cè)序數(shù)據(jù)前面20個(gè)左右的堿基和800以后的堿基可信度不是太高，如果出錯(cuò)在這些區(qū)域重新選擇測(cè)序引物。 PS： Sanger法測(cè)序，在測(cè)序反應(yīng)結(jié)束后，需要進(jìn)行乙醇純化的步驟，一般30bp以內(nèi)的小片段會(huì)丟失，所以所得測(cè)序數(shù)據(jù)的起始?jí)A基是測(cè)序引物后30bp以外的序列。當(dāng)用PCR引物作為測(cè)序引物時(shí)，測(cè)序結(jié)果中是不包含引物序列的。若希望得到引物序列，可通過(guò)以下兩種方法：① 對(duì)于長(zhǎng)度<800bp的PCR產(chǎn)物，可用另一端的引物進(jìn)行測(cè)序，所得序列的末端就包含引物的反向互補(bǔ)序列。② 對(duì)于較長(zhǎng)的序列，一個(gè)測(cè)序反應(yīng)無(wú)法測(cè)通，可通過(guò)將PCR產(chǎn)物片段克隆到適當(dāng)?shù)妮d體，用載體上的通用引物進(jìn)行測(cè)序。由于載體上的通用引物與插入序列之間還有一段距離，因此可以獲得完整的PCR引物序列。另外，測(cè)序起始端的堿基容易發(fā)生誤讀，若您希望獲得PCR產(chǎn)物的完整序列，建議克隆后再測(cè)序。 |
2樓2014-05-23 08:39:07
love犬夜叉
木蟲 (小有名氣)
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3樓2014-05-24 16:23:41
4樓2014-05-24 19:01:12
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