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復(fù)雜模板，pcr，求指導(dǎo)？？？ 已有5人參與
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復(fù)雜模板，染色體脆性位點(diǎn)附近，全基因組PCR換了6對(duì)對(duì)引物p不出來，主要是雜帶太多，主帶不明顯，切膠回收再進(jìn)行巢式pcr也試了，同一對(duì)引物巢式pcr產(chǎn)物切膠回收測(cè)序結(jié)果也不對(duì)，，換更短片段的引物做巢式pcr主帶基本看不見了，雜帶還是很多，求指導(dǎo)？？？我要擴(kuò)增產(chǎn)物必須包括360~560大小 http://www.gaoyang168.com/bbs/post.php?action=newthread&fid=366 >gi|568815591|ref|NC_000007.14|:128207397-128208617 Homo sapiens chromosome 7, GRCh38 Primary Assembly 1 GTGGGAACTG GGTGTACTGA CACTGTGGAA CCAAGGAAGC ACCACGGCTG CAGAGAGACC 61 CTGGGCCAGA CCATCCAAAT GAAGCCCAGG CACAGCAGAG GGCTCTGAGG AGGCGCAGGA 121 TGCAGGAGAT GAAAGGGGAA AATGAAGGGG AGCCGCAGGT TCAAACTGCC CCTTCCCAGG 181 AGTGAGCTAC AGCTTGGCCA CTTCTGTCTC ATAAGAAGGA GGTTGTGACT TTGGGAGGTG 241 GAGGGGGATT ACAGCTGGGA TTCCTGTTGC CTGCCTCCTG CCTCTGGGGC TCTCAGCTTT 301 CTCTTCTCCC CAGGACTCTT TTCTTCCTCT CCCCCCACCT CCCCCCCCAC TCCCCTCCTC 361 CCCCTAGGTC CTGGCTCTCC CTCCCCGACC CGGTCTTCTT GGTACCAGCT AAGCCCTGGA 421 GGGGCCACAG CCTCCCCTCC AGCCCCCCTG CCATGGGATG GCTGCTGTCT CCTTTGGATC 481 TTTTTGCGGT CTGGGCTTGC TGTTCCTCTC AACAGTAGTC AGGAAGCCCT TACCCCAAAA 541 AGTATCTGCG GGAGGCCTTG TCCACAGGGG AGGCTGCCCC AAGGGCTCCA GGTGAGTCAC 601 AGCAAACCCA AGAACAGTGA ATGGAACTGG GGTCTCCTGG CTCTCCTTTA GAGTTGCTGA 661 GTGACTTTAA GTCCAGCACT GAGCCTCTCT GGGCCTCACT TATGCCACTC TTTTCATCAT 721 TTACCAGTGG GCAATGTCAA GTGAGAGACT CCACAGATAA GAAAAATAAA GGAGTGGCTC 781 AATTACATGC CAGGGAAAAC CGCTTTGGTG GATGAAGGTC ACACAGCTCT CCCAGCATTC 841 TGTCCTCTGT ATACAGATGA TCTCCTTCTG AAATCCTTTT GGGGATGACC CCCTTCCACA 901 CCATGGACAC TTCTGGGTGG GTTGTCACTC AAGAGGTCCT GCCCTCTTCT GCCCACTGGG 961 TGGACACAAG AATTGAAATC TGTAAAGGAT ACTGAGATTG GGAACAAAAT AATTGATGCT 1021 GATTGATCCC AGCAGTGTAT GGCGAGAAGA TGACAAGCTT CCACTGCCTG TATCACTGAC 1081 TTGCCTAATG TCTGCCCTGC CCTGGCCTGG ATCTTAACCG CGCCCTTCAT TCTGTGAACT 1141 ACCCCCAAAT CCTTCAAATA AAGTCCTTGA TTGCTTGTTA GAGTCAATAA TATTGCTTGC 1201 TGAGGATCCA GAGACCTCTA G |
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zhangyunjing
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【答案】應(yīng)助回帖
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306495799(西門吹雪170代發(fā)): 金幣+3, 鼓勵(lì)回帖交流 2014-07-04 08:53:26
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對(duì)上述幾對(duì)引物進(jìn)行特異性分析，特異性好些的是502-F/R和754-F/R，其他幾對(duì)引物的特異性很差。502-F/R的Tm值為60℃，建議采用降落PCR，從65℃降至55℃，每?jī)蓚�(gè)循環(huán)降低2℃，最后55℃退火25個(gè)循環(huán)。754-F/R的Tm值為68℃，建議退火溫度設(shè)為63℃。若想進(jìn)一步提高特異性的話，可以在反應(yīng)體系中加入終濃度為0.5-1 M 甜菜堿提高擴(kuò)增的特異性。若要求保真性高的話，建議采用Thermo公司的pfu DNA Polymerase，這個(gè)酶和降落PCR搭配在一起擴(kuò)增的效果很好。 502F-R.jpg 754F-R.jpg |
15樓2014-06-12 15:44:42
zhangyunjing
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2樓2014-06-11 10:37:49
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duowan17
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【答案】應(yīng)助回帖
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感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
306495799(myprayer代發(fā)): 金幣+2, 贈(zèng)人玫瑰手有余香，分子生物期待你更多精彩。 2014-06-11 12:25:29
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全基因組PCR出現(xiàn)大量雜帶很正常的，因?yàn)槟阋锏奶禺愋詫?duì)于整個(gè)基因組來說基本不可能太特異。 我的建議是：如果有全基因組的序列，尋找基因組上特有的酶切位點(diǎn)（該酶切位點(diǎn)一定要少，但其中兩個(gè)位點(diǎn)之間能包括你的基因片段，也可以是多個(gè)位點(diǎn)），酶切，回收包含有你目的片段的部分，然后作為模板再進(jìn)行PCR。 |
4樓2014-06-11 11:02:17
5樓2014-06-11 13:56:36
Neo2000
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6樓2014-06-11 14:40:42
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7樓2014-06-11 15:04:32
zhangyunjing
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8樓2014-06-11 15:42:07
9樓2014-06-11 17:12:26
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退火試過55,58,60，時(shí)間30s，引物設(shè)計(jì)有 502-F ATAAGAAGGAGGTTGTGACTTTGGG 502-R AAGAGTGGCATAAGTGAGGCCC 595-F GCCACTTCTGTCTCATAAGAAGGAG 595-R GGCATGTAATTGAGCCACTCCT 474F-GGCTCTCAGCTTTCTCTTCTC 474R-CTTATCTGTGGAGTCTCTCACTTG 487F-GATTACAGCTGGGATTCCTGT 487R-TGCCCACTGGTAAATGATGAA 754F-CCTGGGCCAG ACCATCCAAA TGAAGC 754R-ATCCACCAAA GCGGTTTTCC CTGGCA ,因?yàn)橐獢U(kuò)增500bp左右的產(chǎn)物后期酶切驗(yàn)證，754bp稍微好點(diǎn)，但是切膠回收再次pcr送樣測(cè)序結(jié)果不對(duì) QQ截圖20140611174030.jpg QQ截圖20140611174121.jpg QQ截圖20140611174150.jpg |
10樓2014-06-11 17:44:05
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