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北京石油化工學院2026年研究生招生接收調(diào)劑公告
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306495799

鐵蟲 (小有名氣)

[求助] 復雜模板,pcr,求指導??? 已有5人參與

復雜模板,染色體脆性位點附近,全基因組PCR換了6對對引物p不出來,主要是雜帶太多,主帶不明顯,切膠回收再進行巢式pcr也試了,同一對引物巢式pcr產(chǎn)物切膠回收測序結(jié)果也不對,,換更短片段的引物做巢式pcr主帶基本看不見了,雜帶還是很多,求指導???我要擴增產(chǎn)物必須包括360~560大小
http://www.gaoyang168.com/bbs/post.php?action=newthread&fid=366

>gi|568815591|ref|NC_000007.14|:128207397-128208617 Homo sapiens chromosome 7, GRCh38 Primary Assembly
1        GTGGGAACTG GGTGTACTGA CACTGTGGAA CCAAGGAAGC ACCACGGCTG CAGAGAGACC
61       CTGGGCCAGA CCATCCAAAT GAAGCCCAGG CACAGCAGAG GGCTCTGAGG AGGCGCAGGA
121      TGCAGGAGAT GAAAGGGGAA AATGAAGGGG AGCCGCAGGT TCAAACTGCC CCTTCCCAGG
181      AGTGAGCTAC AGCTTGGCCA CTTCTGTCTC ATAAGAAGGA GGTTGTGACT TTGGGAGGTG
241      GAGGGGGATT ACAGCTGGGA TTCCTGTTGC CTGCCTCCTG CCTCTGGGGC TCTCAGCTTT
301      CTCTTCTCCC CAGGACTCTT TTCTTCCTCT CCCCCCACCT CCCCCCCCAC TCCCCTCCTC
361      CCCCTAGGTC CTGGCTCTCC CTCCCCGACC CGGTCTTCTT GGTACCAGCT AAGCCCTGGA
421      GGGGCCACAG CCTCCCCTCC AGCCCCCCTG CCATGGGATG GCTGCTGTCT CCTTTGGATC
481      TTTTTGCGGT CTGGGCTTGC TGTTCCTCTC AACAGTAGTC AGGAAGCCCT TACCCCAAAA
541      AGTATCTGCG GGAGGCCTTG TCCACAGGGG AGGCTGCCCC AAGGGCTCCA GGTGAGTCAC
601      AGCAAACCCA AGAACAGTGA ATGGAACTGG GGTCTCCTGG CTCTCCTTTA GAGTTGCTGA
661      GTGACTTTAA GTCCAGCACT GAGCCTCTCT GGGCCTCACT TATGCCACTC TTTTCATCAT
721      TTACCAGTGG GCAATGTCAA GTGAGAGACT CCACAGATAA GAAAAATAAA GGAGTGGCTC
781      AATTACATGC CAGGGAAAAC CGCTTTGGTG GATGAAGGTC ACACAGCTCT CCCAGCATTC
841      TGTCCTCTGT ATACAGATGA TCTCCTTCTG AAATCCTTTT GGGGATGACC CCCTTCCACA
901      CCATGGACAC TTCTGGGTGG GTTGTCACTC AAGAGGTCCT GCCCTCTTCT GCCCACTGGG
961      TGGACACAAG AATTGAAATC TGTAAAGGAT ACTGAGATTG GGAACAAAAT AATTGATGCT
1021     GATTGATCCC AGCAGTGTAT GGCGAGAAGA TGACAAGCTT CCACTGCCTG TATCACTGAC
1081     TTGCCTAATG TCTGCCCTGC CCTGGCCTGG ATCTTAACCG CGCCCTTCAT TCTGTGAACT
1141     ACCCCCAAAT CCTTCAAATA AAGTCCTTGA TTGCTTGTTA GAGTCAATAA TATTGCTTGC
1201     TGAGGATCCA GAGACCTCTA G
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也許似乎大概是,然而未必不見得
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luwei13566

木蟲 (正式寫手)

【答案】應助回帖


感謝參與,應助指數(shù) +1
306495799(西門吹雪170代發(fā)): 金幣+1, 鼓勵回帖交流 2014-06-11 18:53:46
你的基因序列GC含量不低吧。用G Cbuffer試試,而且rTaq太垃圾了,換點好酶試試。
大家相互幫助哈
7樓2014-06-11 15:04:32
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zhangyunjing

金蟲 (小有名氣)

【答案】應助回帖


感謝參與,應助指數(shù) +1
myprayer: 金幣+1, 贈人玫瑰手有余香,分子生物期待你更多精彩。 2014-06-11 12:25:15
可以采用好的熱啟動酶,或采用降落PCR,能很好的減少非特異擴增
rainwater
2樓2014-06-11 10:37:49
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306495799

鐵蟲 (小有名氣)

我一直用的takara的rtaq,降落pcr循環(huán)數(shù)怎么控制呢,我之前都是35循環(huán)
也許似乎大概是,然而未必不見得
3樓2014-06-11 10:59:45
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duowan17

金蟲 (正式寫手)

【答案】應助回帖

★ ★
感謝參與,應助指數(shù) +1
306495799(myprayer代發(fā)): 金幣+2, 贈人玫瑰手有余香,分子生物期待你更多精彩。 2014-06-11 12:25:29
全基因組PCR出現(xiàn)大量雜帶很正常的,因為你引物的特異性對于整個基因組來說基本不可能太特異。
我的建議是:如果有全基因組的序列,尋找基因組上特有的酶切位點(該酶切位點一定要少,但其中兩個位點之間能包括你的基因片段,也可以是多個位點),酶切,回收包含有你目的片段的部分,然后作為模板再進行PCR。
4樓2014-06-11 11:02:17
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