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zhpu2008銅蟲(chóng) (小有名氣)
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[求助]
關(guān)于熒光定量PCR擴(kuò)增曲線的疑問(wèn) 已有3人參與
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各位大俠好，近兩天做熒光定量PCR，但擴(kuò)增曲線，有的正常，有的不正常，甚至是三個(gè)重復(fù)里面就差別較大，深藍(lán)色是3個(gè)重復(fù)，淺藍(lán)色是3個(gè)重復(fù)，有圖附上，大家看看，幫忙分析原因，謝謝！ quxian.jpg |
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小木蟲(chóng): 金幣+0.5, 給個(gè)紅包，謝謝回帖
zhpu2008(西門吹雪170代發(fā)): 金幣+5, 鼓勵(lì)回帖交流 2014-06-28 13:05:06
小木蟲(chóng): 金幣+0.5, 給個(gè)紅包，謝謝回帖
zhpu2008(西門吹雪170代發(fā)): 金幣+5, 鼓勵(lì)回帖交流 2014-06-28 13:05:06
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Real Time PCR根據(jù)其原理，可以在PCR體系里加入熒光染料或者用特異性的熒光探針。我經(jīng)常用的是前者，你的應(yīng)該也是。 熒光染料法，對(duì)引物的要求還是挺高的，根據(jù)你的擴(kuò)增曲線，排除加樣過(guò)程中的誤差，我認(rèn)為 你的引物不好。 建議你做Relatime之前，最好先把引物檢測(cè)一下。Relatime檢測(cè)，就是一個(gè)引物準(zhǔn)備兩個(gè)上樣孔，A.正常加樣；B.把cDNA換成定量的H2O，看溶解曲線。好的引物溶解曲線，A孔只有一個(gè)峰，B孔沒(méi)有峰。 另外加樣的時(shí)候，最好混合一個(gè)體系，計(jì)算好用量，一個(gè)孔一個(gè)孔的分裝，微量的如引物最好不要單獨(dú)加，這樣誤差很大的。 圖片是我做的，你可以參考下。 擴(kuò)增曲線.jpg 溶解曲線.jpg |
2樓2014-06-28 10:40:49
3樓2014-06-28 13:07:40
4樓2014-06-28 20:12:56
zhpu2008
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