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zhllhzzhl銅蟲 (小有名氣)
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[求助]
求助！WB條帶不清楚 已有1人參與
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小弟做western blot有段時(shí)間了， 最近做小鼠DC細(xì)胞 A20的干擾，結(jié)果western blot不知怎么了， 第一次做的時(shí)候能用抗體砸的出來，但后面重復(fù)的時(shí)候卻總是跑得很臟，條帶不清。 請(qǐng)教各位大神，不知是否有遇到這樣的情況？還請(qǐng)各位不吝賜教！謝謝啦 PS：1.中間變化的條件主要是轉(zhuǎn)膜條件由100A 50mins 換到100v 60mins，有可能因?yàn)檗D(zhuǎn)過了么？（100A 50mins 最上2條條帶沒完全轉(zhuǎn)過來） 2. 由于懷疑是wb中涉及buffer的原因（圖2），做過dot plot檢驗(yàn)試劑，的確實(shí)用的RIPA buffer對(duì)抗體有反應(yīng)， 所以后面用重新配制過，結(jié)果還是一樣（圖三，下面一道為beta-actin，上面模糊的就是我要的條帶） 3. A20大約分子量90kd， 但是砸出來的大概只有80kd，這樣應(yīng)該還正常吧？ 4. 為了得到條帶，最近增長(zhǎng)曝光時(shí)間，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在用A20抗體的時(shí)候直接砸出了一條大概30+kd的條帶 圖4（曝光直接先出來的） 5. 有可能是蛋白降解么？ 但是如果是蛋白降解 beta-actin條帶也還是很清晰；gel也同時(shí)跑了平行樣，烤藍(lán)對(duì)照排除gel的問題 第一次跑的條帶 圖2 后面跑的條帶 第一道為loding buffer 第二道為marker 圖3 圖4 |
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zhllhzzhl
銅蟲 (小有名氣)
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3樓2014-07-07 08:17:36
biotech_zhou
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【答案】應(yīng)助回帖
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感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
youlinglyw: 金幣+2, 贈(zèng)人玫瑰手有余香，生物科學(xué)有你更精彩！ 2014-07-07 08:53:20
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| 最后出的圖說明樓主的實(shí)驗(yàn)體系應(yīng)該沒什么問題，轉(zhuǎn)過去的可能性不大，分子量大小無法用marker精確判斷，所以你說的大小應(yīng)該在接受的范圍，曝光時(shí)間建議縮短，這樣可以減少非特異性條帶出現(xiàn)，內(nèi)參含量非常豐富目的蛋白是否降解不可以用內(nèi)參來判斷，建議樓主可重新提取幾個(gè)蛋白預(yù)試。 |
2樓2014-07-03 10:02:04
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