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huoxingyihao

新蟲 (初入文壇)

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[求助] 枯草基因組為模板，pcr沒有東西？已有1人參與

基因組沒有問題，換了兩個引物，第一個引物是有一些雜帶，但是沒有我要的帶，第二個引物直接什么也p不出來，目的條帶應(yīng)該一千多？會是什么原因呢？

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1樓 2014-07-04 22:10:58

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考拉003

新蟲 (小有名氣)

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【答案】應(yīng)助回帖

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huoxingyihao: 金幣+5, ★★★★★最佳答案 2014-08-27 16:13:32

額，你這個還真不知道怎么說，你只有試試看了
1，模板是提取的基因組還是做菌落PCR，我們實(shí)驗(yàn)室現(xiàn)在做PCR常用EP管裝30Ul無菌水將劃線的菌挑一點(diǎn)，沸水煮10分鐘，PCR效果非常，你可以試試；
2，其次看你的體系有沒有問題，這個應(yīng)該沒啥問題的
3，引物的特異性強(qiáng)不強(qiáng)，采用軟件設(shè)計(jì)引物除了看得分外還看引物之間會不會形成二聚體之類的，發(fā)夾結(jié)構(gòu)什么的。
4，你說的1Kb的帶應(yīng)該不是很大，引物多長？20堿基左右嗎？引物太長退火時的時間考慮增加一下，并且退火溫度做個梯度，52——58度試試吧。
PCR似乎是個最基本的克隆技術(shù)，引物是很重要的，主要關(guān)注一下引物和退火溫度及時間吧。

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回復(fù)此樓

不是微生物專業(yè)的卻進(jìn)入微生物行業(yè)

2樓2014-07-04 23:23:23

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