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[求助]
目的片段載體片段連接不長(zhǎng)菌 已有5人參與
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求助： 目前在做連接反應(yīng)，目的片段3.7kb，載體片段5.5kb，均為雙酶切后膠回收獲得，將目的片段和載體片段進(jìn)行連接，連接體系25ul(目的片段10ul，載體6ul，10*T4ligase buffer 2.5ul ,T4 ligase1ul)用的TAKALA家的T4連接酶試劑盒，16度連接過夜，化學(xué)轉(zhuǎn)化，圖板，均不長(zhǎng)菌。做了陽(yáng)性對(duì)照證明感受態(tài)和平板都是沒有問題的，但為什么連接不長(zhǎng)菌的，一個(gè)都不長(zhǎng)，求各位大俠相助！幫幫忙吧 |
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gyesang: 金幣+4, 鼓勵(lì)回帖交流！ 2014-07-18 18:16:21
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我覺得你可以考慮以下幾點(diǎn)： 1、酶切位點(diǎn)是否合適，包括位置和酶切位點(diǎn)數(shù)量； 2、目的基因插入序列方向是否正確； 3、篩選條件是否合適，如你插入的位點(diǎn)是否位于相應(yīng)抗性基因內(nèi)部； 4、目的基因與載體片段是否成功回收到； 5、所回收的載體片段是否是自己需要的那一部分； 6、檢查BUFFER與酶是否匹配； 7、限制性內(nèi)切酶是否真的失活了。 |
7樓2014-07-18 16:54:08
songzuowei
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2樓2014-07-18 10:33:04
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3樓2014-07-18 10:45:27
鬼羽帝魂
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【答案】應(yīng)助回帖
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gyesang: 金幣+3, 鼓勵(lì)回帖交流！ 2014-07-18 15:33:40
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gyesang: 金幣+3, 鼓勵(lì)回帖交流！ 2014-07-18 15:33:40
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連接體系25ul(目的片段10ul，載體6ul，10*T4ligase buffer 2.5ul ,T4 ligase1ul。。。 這個(gè)太大了吧。 你試試這個(gè)： 載體：19.8X載體大小/（1000X載體濃度）ul 片段：99X片段大小/（1000X片段濃度）ul T4酶： 1ul 10XT4 buffer：1ul ---------------------------------------------- 10ul 16度8-10h或過夜 上面公式中載體：片段的摩爾比為1:5，如果載體、片段的濃度太小而需要大量加的時(shí)候，你按相同的比例縮減所加的量。但載體的量為30-50ng是至少的。 |
4樓2014-07-18 15:02:42
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