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hnsea銅蟲 (小有名氣)
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[求助]
細(xì)菌質(zhì)粒提取及ＰＣＲ 已有4人參與
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如題，細(xì)菌用小提試劑盒提取質(zhì)粒，濃度在幾十至100ug/ml。 進(jìn)行多個相關(guān)耐藥基因（200-500bp）擴(kuò)增并電泳檢測，沒有一個條帶。marker(1000bp)也不亮，沒完全分開。 是操作設(shè)計(jì)不好嗎�。� 請分析下原因。 pcr條件如下:94度預(yù)熱5-8min，94變性40S，Tm減5度退火40S,72度再延伸40s，重復(fù)30個循環(huán)，72度再延伸5min，4度保持。 瓊脂糖電泳條件:1%的膠，120ev，120mA. |
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zff922
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雖然看的晚了，但是還是忍不住說兩句，首先樓主的水平太低了，另外回答者都是針對的一些細(xì)枝末節(jié)的地方挑毛病，也算是無病呻吟吧。首先有說電壓的，有說PCR體系的還有說模版的。我都無語了，如果樓主用試劑盒抽質(zhì)粒或者PCR都有問題，我真是要佩服了。按部就班的東西很少出錯的，電壓160V和100V跑出來的效果也不會差太多，膠做不好可以重復(fù)一下用MARKER做對照。 總之，我認(rèn)為如果不是樓主失誤的話，就是質(zhì)粒很不就不是陽性質(zhì)粒，你應(yīng)該以菌落PCR先鑒定，而且引物要一個是目的基因的一個是vector上的通用引物。陽性的就可以搖菌抽質(zhì)粒了。抽出來的質(zhì)粒其實(shí)不需要再鑒定了，不過保險一點(diǎn)再鑒定也可以，模版0.2微升就可以。后面要是有問題就是初級水平的問題。至少是大學(xué)生水平不應(yīng)該出的問題更別說研究生了。 |
9樓2014-12-03 14:27:11
songzuowei
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2樓2014-07-28 09:37:50
hnsea
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3樓2014-07-28 09:51:01
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4樓2014-07-28 10:51:00
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