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hnsea銅蟲 (小有名氣)
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[求助]
細菌質(zhì)粒提取及ＰＣＲ 已有4人參與
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如題，細菌用小提試劑盒提取質(zhì)粒，濃度在幾十至100ug/ml。 進行多個相關耐藥基因（200-500bp）擴增并電泳檢測，沒有一個條帶。marker(1000bp)也不亮，沒完全分開。 是操作設計不好嗎��？ 請分析下原因。 pcr條件如下:94度預熱5-8min，94變性40S，Tm減5度退火40S,72度再延伸40s，重復30個循環(huán)，72度再延伸5min，4度保持。 瓊脂糖電泳條件:1%的膠，120ev，120mA. |
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songzuowei
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hnsea: 金幣+2, ★有幫助 2014-07-29 22:50:54
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I give you a experiment plan: first: Agarose electrophoresis conditions: 0.8% glue, 120 V, 100mA. second: PCR conditions : preheated 94 degrees 9 min, 94 modified 30S, annealing of 30S, extends 30s, repeated for 28 cycles, 72 degrees and then extends 5min, 4 degrees. |
6樓2014-07-29 14:24:20
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【答案】應助回帖
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gyesang: 回帖置頂 2014-07-29 16:41:11
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gyesang: 回帖置頂 2014-07-29 16:41:11
| 一半電泳時電壓120V電流不會有那么高吧，當電流升高太多，這個時候電泳緩沖液肯定是要換了的。如果片段較小，可以采用較大濃度的膠（1.5%-2%），電壓80-100v可能能跑的更清楚，PCR模板的話濃度達到10都完全可以用，如果有100，擔心模板中可能有污染物，你可稀釋十倍在做模板也行。質(zhì)粒抽提一般都可以達到上百吧。PCR條件沒多少問題，退火溫度可以嘗試優(yōu)化一下，變性、退火、延伸30s都足夠，循環(huán)一般30-35。 |
7樓2014-07-29 15:19:22
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雖然看的晚了，但是還是忍不住說兩句，首先樓主的水平太低了，另外回答者都是針對的一些細枝末節(jié)的地方挑毛病，也算是無病呻吟吧。首先有說電壓的，有說PCR體系的還有說模版的。我都無語了，如果樓主用試劑盒抽質(zhì)�；蛘逷CR都有問題，我真是要佩服了。按部就班的東西很少出錯的，電壓160V和100V跑出來的效果也不會差太多，膠做不好可以重復一下用MARKER做對照。 總之，我認為如果不是樓主失誤的話，就是質(zhì)粒很不就不是陽性質(zhì)粒，你應該以菌落PCR先鑒定，而且引物要一個是目的基因的一個是vector上的通用引物。陽性的就可以搖菌抽質(zhì)粒了。抽出來的質(zhì)粒其實不需要再鑒定了，不過保險一點再鑒定也可以，模版0.2微升就可以。后面要是有問題就是初級水平的問題。至少是大學生水平不應該出的問題更別說研究生了。 |
9樓2014-12-03 14:27:11
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