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swach鐵蟲 (小有名氣)
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[求助]
菌落PCR第一次有，第二次就沒有了？什么原因 已有6人參與
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| 昨天做菌落PCR ，第一次沒出來，全是拖帶，考慮是引物（M13）的問題，所以換了引物，隨機選了16個菌液做菌落PCR，結果出來了10個，覺得比例還行，今天就把96個全跑了PCR，之后挑了22個跑電泳，結果基本全是拖帶,而且點樣孔的地方特別亮，只有三四個有條帶的，還很暗。大神，請求幫忙�。。�！真的很急，已經做了一個月了。 |
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2樓2014-08-03 20:25:10
swach
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6樓2014-08-04 12:55:02
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【答案】應助回帖
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菌液PCR的假陽性的原因和解決方法(凌波麗，2014年7月24日) 1.建議樓主做陰性對照，陽性對照，檢查是否存在污染。 2.假陽性可能的來源是未能和載體連接上的插入片段，這不相當于普通PCR的模板提取的那一步，這步的關鍵可能是保證挑的細菌克隆的確都能保證是陽性克隆。 3.菌液PCR假陽性也可能是引物設計有問題，引起不專一性PCR擴增。 4.可以加強DNA聚合酶的專一性（這步和普通PCR相同）： （1）Taq DNA聚合酶的專一性擴增不夠。改用專一性更強的DNA聚合酶，或者使用兩種不同的DNA聚合酶，減低酶量或調換另一來源的專一性高的酶。更換DNA聚合酶時，酶量不要太大，以免出現特異性擴增。 （2）酶制劑中的甘油可能也是干擾因素�？梢约尤刖篜CR反應體系之前用超濾去除酶制劑中的甘油。 （3）在反應體系中加入：1.0mol/L的甜菜堿或者5%的DMSO可以提高PCR擴增效率，兩者可以穩(wěn)定 DNA聚合酶。 5.是否存在菌液PCR的反應體系之外的DNA污染源 菌液PCR的反應體系被污染：這種污染有兩種原因： 第一種可能：大片段的交叉污染，導致非特異性帶出現。 這種非特異性帶出現可用以下方法解決： （1）在加樣槍的接頭和吸桿之間加上脫脂消毒棉花，防止以前操作時將其他的DNA靶序列吸入加樣槍內。 （2）除了酶及不能耐高溫的物質外，所有試劑或器材均應高壓消毒。 （3）所用離心管及樣進槍頭等均應一次性使用。必要時，在加標本前，反應管和試劑用紫外線照射，以破壞存在的核酸。 第二種可能：空氣中的小片段核酸污染，這些小片段比靶序列短，但有一定的同源性。有時候可能會互相拼接，與引物互補后，可擴增出PCR產物，而導致非特異性帶出現的產生。雖然這樣的可能性比較小。 對策：實驗前對實驗室充分通風，試驗時盡量加上PCR試劑暴露于空氣中的時間。 6.反應體系過大，模板DNA和非模板DNA過多引起了非特異性擴增。 7. 目的DNA模板可能本身存在某些問題，比如與一些蛋白質發(fā)生了較牢固的結合（特異性或者非特異性）-----因為細菌也有類核，而這樣的結合在裂解細菌由于某些因素沒有去除，或者目的DNA模板的拓撲結構有某些問題。第7點只是我從細菌分子生物學角度做的猜測。第7條成為原因的可能性極小。 因為如果挑的陽性克隆沒有問題，同時PCR的引物也肯定能夠與目的模板互補的話，那么出現目的DNA擴增片段應該不是問題，也可能有非特異性擴增存在，但是只有非特異性擴增的話，所以此時就要考慮什么原因阻止了目的DNA的擴增。 8.引物的特異性差，受非特異性的PCR擴增的競爭性抑制作用的影響，靶基因的PCR擴增效率低，特異性的PCR產物極少。第1條措施到第6條措施均無效，則必須考慮重新設計引物。 可能有網友會說我想的太多了，想得多不多沒有太大意義，關鍵是能不能解決問題，方案是否有可操作性。 |
7樓2014-08-05 01:51:44
tuodecai
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8樓2014-08-05 03:12:39
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