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1樓 2014-08-31 19:08:00

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ganchao1776

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第一步、轉(zhuǎn)化后營(yíng)養(yǎng)缺陷篩選（注意不要污染）；第二步，菌落PCR驗(yàn)證轉(zhuǎn)進(jìn)去（可省略）；第三步，抗生素梯度篩選高拷貝轉(zhuǎn)化子（一般1.5mg G418濃度獲得高表達(dá)的機(jī)率比較高）；第四步，甲醇誘導(dǎo)篩選高表達(dá)轉(zhuǎn)化子。如果前邊沒(méi)有好好的做，想省勁兒，獲得成功的可能性不是很大呀。

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8樓2014-09-01 17:37:04

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miclebibi

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10樓: Originally posted by 邱玉信 at 2014-09-01 22:08:56
你好，如果做westen我想問(wèn)下怎樣設(shè)計(jì)相關(guān)重組蛋白的抗體呢？...

抗體的選擇可以上NCBI檢索Protein中你的目的蛋白，右側(cè)有一個(gè)抗體的鏈接（連到http://www.labome.com）上面有該抗體哪些公司有，你的蛋白應(yīng)該很好找的

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14樓2014-09-02 12:04:56

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zhaocy8903

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邱玉信(西門吹雪170代發(fā)): 金幣+2, 鼓勵(lì)回帖交流 2014-09-01 19:23:04

(1)外源蛋白在畢赤酵母中不能得到表達(dá)也是常見(jiàn)的�？梢酝ㄟ^(guò)優(yōu)化基因序列，啟動(dòng)子以及分泌信號(hào)等來(lái)嘗試解決一下，但不要抱太大期望。
（2）如果你的蛋白有糖基化位點(diǎn)的話分子量可能會(huì)增加。

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2樓2014-08-31 21:47:00

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邱玉信

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3樓: Originally posted by 邱玉信 at 2014-08-31 22:17:22
首先謝謝你！我沒(méi)有說(shuō)我的外源蛋白沒(méi)有表達(dá)，我的意思是說(shuō)就算外源蛋白表達(dá)了，用上面這兩種方法也很難驗(yàn)證，想請(qǐng)教一下還有其它的方法不？...

從電泳結(jié)果看，至少可以說(shuō)沒(méi)有明顯的表達(dá)條帶。即使有微量的表達(dá)，以后的純化也很難做的。

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4樓2014-08-31 22:26:21

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這種情況必須用westen驗(yàn)證了，從的sds-page看不出什么區(qū)別，設(shè)計(jì)你重組蛋白的抗體，做一下westen就行，不知道你的重組策略，如果有標(biāo)簽什么的還是可以純化的

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6樓2014-09-01 09:01:44

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dongge2013

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類似的表達(dá)我也做過(guò)，就做到這一步，蒙混過(guò)關(guān)，勉強(qiáng)畢業(yè)了

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7樓2014-09-01 16:23:28

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