fuchange918

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[求助] Trizol 法怎么提取高質(zhì)量RNA 已有5人參與

本人實(shí)驗(yàn)真菌用Trizol法提取RNA后，跑膠驗(yàn)證降解程度還可以忍受，但是污染方面很嚴(yán)重：OD260/280=1.5左右，OD260/230=1.0左右，后期需要做RACE
主要有一下問(wèn)題：
（1）試驗(yàn)中哪些試劑需要預(yù)冷（4度還是-20℃），比如氯仿、異丙醇、75%乙醇
（2）每次異丙醇沉淀離心后，管壁上總是粘有和底部沉淀一樣的東西，而且沉淀用DEPC處理水溶解時(shí)總是不能全部溶解，應(yīng)該怎么解決？
（3）還有就這這么步驟中的放置時(shí)間，幫我看看有沒(méi)有問(wèn)題，是過(guò)長(zhǎng)還是過(guò)短
本人RNA提取步驟：
1、細(xì)胞或組織加 Trizol 后，室溫放置 5min，使其充分裂解。。
2、12,000rpm 離心 10min，棄沉淀。
3、按 200ul 氯仿/ml Trizol 加入氯仿，上下顛倒混勻后冰上放置5min。
4、4℃ 12,000g 離心 15min。
5、吸取上層水相，至另一離心管中
6、按 0.5ml 異丙醇/ml Trizol 加入異丙醇混勻，冰浴放置10min。
7、4℃ 12,000g 離心 10min，棄上清，RNA 沉于管底。
8、按 1ml 75%乙醇/ml Trizol 加入 75%乙醇，溫和振蕩離心管，懸浮沉淀。
9、 4℃ 8,000g 離心 5min，盡量棄上清。
10、室溫晾干或真空干燥 5-10min。注：RNA 樣品不要過(guò)于干燥，否則很難溶解。
11、可用 30ul DEPC處理水溶解RNA樣品

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1樓 2014-09-05 14:41:53

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gyesang: 金幣+2, 鼓勵(lì)回帖交流！ 2014-09-05 14:59:15

建議將后面的6-11步，更改為過(guò)柱法。
RNA專用純化柱，獲得RNA純度更高，量會(huì)損失小許。

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有你真好

2樓2014-09-05 14:50:54

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fuchange918

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引用回帖:

2樓: Originally posted by a314919473 at 2014-09-05 14:50:54
建議將后面的6-11步，更改為過(guò)柱法。
RNA專用純化柱，獲得RNA純度更高，量會(huì)損失小許。

柱子法是不是很貴啊

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3樓2014-09-05 15:38:53

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niil

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fuchange918: 金幣+3, ★有幫助 2014-09-05 21:03:41

所需氯仿乙醇異丙醇常溫即可。
離心的時(shí)候4度，其他操作常溫也沒(méi)有問(wèn)題的。
第6步，一般還是加入等體積的異丙醇來(lái)沉淀。
“每次異丙醇沉淀離心后，管壁上總是粘有和底部沉淀一樣的東西，”跟離心時(shí)不平衡有關(guān)。
污染嚴(yán)重的話，可能是樣品量比較大，抽提不徹底，蛋白含量高吧。
提RNA的組織量不需要太大。

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Stop fighting,let it flow.

4樓2014-09-05 15:56:04

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引用回帖:

3樓: Originally posted by fuchange918 at 2014-09-05 15:38:53
柱子法是不是很貴啊...

貴不貴要看你自己了，可以買便宜的例如生工的（一次大概10元），也可以買貴的例如QIAGEN的（一次大概70元），做RACE最好是用好一點(diǎn)的，我們也做這個(gè)服務(wù)的。僅供參考

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5樓2014-09-05 15:58:24

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fuchange918: 金幣+2, ★有幫助 2014-09-05 21:03:13

價(jià)格跟質(zhì)量有關(guān)系，便宜的生工（一次10幾元），貴的QIAGEN（一次可能要70元以上）。做RACE做好用好的試劑。僅供參考

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6樓2014-09-05 16:01:13

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zuoyly

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fuchange918: 金幣+1, ★有幫助 2014-09-05 21:03:25

建議使用一個(gè)Vazyme公司的RNA isolater Total RNA Extraction Reagent試試，我使用的挺好的

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7樓2014-09-05 16:31:39

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6樓: Originally posted by a314919473 at 2014-09-05 16:01:13
價(jià)格跟質(zhì)量有關(guān)系，便宜的生工（一次10幾元），貴的QIAGEN（一次可能要70元以上）。做RACE做好用好的試劑。僅供參考

生工的質(zhì)量怎么樣呢

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8樓2014-09-05 21:02:53

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xipha

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fuchange918(西門吹雪170代發(fā)): 金幣+2, 鼓勵(lì)回帖交流 2014-09-06 22:57:26

產(chǎn)物不溶看起來(lái)好像是你的樣品里面蛋白或者糖類的含量比較高,糖類多可以參考植物RNA的提取方法,用氯化鋁溶液先沉淀一遍. 蛋白高的話用酚氯仿多過(guò)一遍. 需要提醒的是這樣處理完純度是高了,RNA的量相對(duì)也小一點(diǎn).

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9樓2014-09-06 04:30:41

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9樓: Originally posted by xipha at 2014-09-06 04:30:41
產(chǎn)物不溶看起來(lái)好像是你的樣品里面蛋白或者糖類的含量比較高,糖類多可以參考植物RNA的提取方法,用氯化鋁溶液先沉淀一遍. 蛋白高的話用酚氯仿多過(guò)一遍. 需要提醒的是這樣處理完純度是高了,RNA的量相對(duì)也小一點(diǎn).

第二遍酚氯仿的量應(yīng)該是多少呢

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10樓2014-09-06 08:10:54

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