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fuchange918木蟲 (正式寫手)
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Trizol 法怎么提取高質(zhì)量RNA 已有5人參與
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本人實(shí)驗(yàn)真菌用Trizol法提取RNA后，跑膠驗(yàn)證降解程度還可以忍受，但是污染方面很嚴(yán)重：OD260/280=1.5左右，OD260/230=1.0左右，后期需要做RACE 主要有一下問(wèn)題： （1）試驗(yàn)中哪些試劑需要預(yù)冷（4度還是-20℃），比如氯仿、異丙醇、75%乙醇 （2）每次異丙醇沉淀離心后，管壁上總是粘有和底部沉淀一樣的東西，而且沉淀用DEPC處理水溶解時(shí)總是不能全部溶解，應(yīng)該怎么解決？ （3）還有就這這么步驟中的放置時(shí)間，幫我看看有沒(méi)有問(wèn)題，是過(guò)長(zhǎng)還是過(guò)短 本人RNA提取步驟： 1、細(xì)胞或組織加 Trizol 后，室溫放置 5min，使其充分裂解。。 2、12,000rpm 離心 10min，棄沉淀。 3、按 200ul 氯仿/ml Trizol 加入氯仿，上下顛倒混勻后冰上放置5min。 4、4℃ 12,000g 離心 15min。 5、吸取上層水相，至另一離心管中 6、按 0.5ml 異丙醇/ml Trizol 加入異丙醇混勻，冰浴放置10min。 7、4℃ 12,000g 離心 10min，棄上清，RNA 沉于管底。 8、按 1ml 75%乙醇/ml Trizol 加入 75%乙醇，溫和振蕩離心管，懸浮沉淀。 9、 4℃ 8,000g 離心 5min，盡量棄上清。 10、室溫晾干或真空干燥 5-10min。注：RNA 樣品不要過(guò)于干燥，否則很難溶解。 11、可用 30ul DEPC處理水溶解RNA樣品 |
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 生物技術(shù)/方法講解 | 經(jīng)驗(yàn)方法/使用說(shuō)明 |
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xipha
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【答案】應(yīng)助回帖
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fuchange918: 金幣+3, ★有幫助 2014-09-05 21:03:41
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fuchange918: 金幣+3, ★有幫助 2014-09-05 21:03:41
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所需氯仿 乙醇 異丙醇常溫即可。 離心的時(shí)候4度，其他操作常溫也沒(méi)有問(wèn)題的。 第6步，一般還是加入等體積的異丙醇來(lái)沉淀。 “每次異丙醇沉淀離心后，管壁上總是粘有和底部沉淀一樣的東西，”跟離心時(shí)不平衡有關(guān)。 污染嚴(yán)重的話，可能是樣品量比較大，抽提不徹底，蛋白含量高吧。 提RNA的組織量不需要太大。 |
4樓2014-09-05 15:56:04
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