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我用自己設(shè)計(jì)的引物擴(kuò)增一段cds序列,結(jié)果出來了與已知的cds序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)有一個(gè)堿基的缺失和17個(gè)堿基的突變,我想問下,這樣能直接往下面做克隆,表達(dá)嗎?還是需要再重新pcr一下?主要我怕后面做表達(dá)會(huì)出現(xiàn)蛋白表達(dá)不正確的情況

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1樓 2014-09-07 11:49:14

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【答案】應(yīng)助回帖

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gyesang: 金幣+2, 鼓勵(lì)回帖交流！ 2014-09-07 17:28:26

當(dāng)然要重新pcr，否則后續(xù)實(shí)驗(yàn)可能遇到麻煩

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2樓2014-09-07 12:00:53

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2樓: Originally posted by xiaomdj at 2014-09-07 12:00:53
當(dāng)然要重新pcr，否則后續(xù)實(shí)驗(yàn)可能遇到麻煩

那需要在哪些方面注意呢?我的循環(huán)次數(shù)是35,我看論壇里其他前輩說30就夠了

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3樓2014-09-07 12:25:35

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我欲乘風(fēng)歸去

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30個(gè)循環(huán)確實(shí)夠了，可以換高保真酶擴(kuò)增（連接T載體時(shí)注意加A尾）

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4樓2014-09-07 14:03:10

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4樓: Originally posted by 我欲乘風(fēng)歸去 at 2014-09-07 14:03:10
30個(gè)循環(huán)確實(shí)夠了，可以換高保真酶擴(kuò)增（連接T載體時(shí)注意加A尾）

我是pcr產(chǎn)物直接測(cè)序的,前兩次做的時(shí)候也用高保真酶了,可是條帶的亮度沒有用rTaq好,所以測(cè)序的時(shí)候就用的是rTaq酶的產(chǎn)物測(cè)序.有17個(gè)堿基突變了,是不是相對(duì)來說這樣后面蛋白的改變是致命的?

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5樓2014-09-07 16:50:14

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【答案】應(yīng)助回帖

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well_想太多(西門吹雪170代發(fā)): 金幣+2, 鼓勵(lì)回帖交流 2014-09-07 20:55:05
西門吹雪170: 應(yīng)助指數(shù)+1 2014-09-07 20:55:23
well_想太多: 金幣+3, ★有幫助 2014-09-07 21:54:07

堿基缺失了才是致命的，缺失后面的全部移碼了，你去把測(cè)過的序列翻譯成氨基酸看一下和原來的氨基酸序列比對(duì)一下，就知道這條序列行不行了

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6樓2014-09-07 18:22:45

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對(duì)了，你用PCR產(chǎn)物測(cè)序，是不是雙向測(cè)的，還有如果你的片段大于800bp后數(shù)據(jù)就不太可靠了，得設(shè)計(jì)引物繼續(xù)測(cè)。

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7樓2014-09-07 18:25:46

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7樓: Originally posted by 我欲乘風(fēng)歸去 at 2014-09-07 18:25:46
對(duì)了，你用PCR產(chǎn)物測(cè)序，是不是雙向測(cè)的，還有如果你的片段大于800bp后數(shù)據(jù)就不太可靠了，得設(shè)計(jì)引物繼續(xù)測(cè)。

是雙向測(cè)通的,片段大小900bp左右.我翻譯了一下序列,確實(shí)出現(xiàn)氨基酸的突變了,看來是不能用了,重新再測(cè)一下吧.

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8樓2014-09-07 21:53:51

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shengwumin

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gyesang: 金幣+2, 鼓勵(lì)回帖交流！ 2014-09-08 12:41:18

樓主忽略了一個(gè)問題：可能不是PCR的問題，問題的根本原因就是你用的樣品中此基因是不是就是突變的。你有檢測(cè)過他的蛋白水平嗎？或者有文獻(xiàn)報(bào)道他嗎？

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9樓2014-09-08 09:59:21

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8樓: Originally posted by well_想太多 at 2014-09-07 21:53:51
是雙向測(cè)通的,片段大小900bp左右.我翻譯了一下序列,確實(shí)出現(xiàn)氨基酸的突變了,看來是不能用了,重新再測(cè)一下吧....

沒有問題的我測(cè)過1200多bp的，照樣出來的序列很好，關(guān)鍵是你的樣品問題。

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10樓2014-09-08 10:00:33

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