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longyh6411金蟲 (小有名氣)
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[求助]
測序結(jié)果很奇怪
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我用A和B是同一物種，該物種的基因組數(shù)據(jù)早就出來了，而且是用A測得的。A和B在我研究的性狀上有很大不同。我P了A和B的與這個形狀相關(guān)的一個相關(guān)基因，片段不大，只有590bp，但是奇怪的事出來了，在3‘的(下游引物結(jié)合區(qū)域內(nèi),而且在做PCR的時候A和B用的是統(tǒng)一管引物)端A和B序列有l(wèi)兩個堿基比對不上，而且A和數(shù)據(jù)庫也比對不上，有一個堿基的缺失另外一個堿基的突變。更關(guān)鍵的就是A的序列這個與B比對不上的堿基形成了終止密碼子。也就是說和數(shù)據(jù)庫相比終止密碼子出現(xiàn)的提前了，也就導(dǎo)致了最后好幾個氨基酸的缺失。 請問這是否是由于下游引物有問題呢還是可能是本身的突變?590單向測序可靠不？以前測了很多序列都沒出現(xiàn)這樣的問題，求高手幫忙 我只做了正向測序，測序是用的PCR產(chǎn)物 [ Last edited by longyh6411 on 2013-2-1 at 18:33 ] |
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【答案】應(yīng)助回帖
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感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
amisking: 金幣+3, MolEPI+1, 鼓勵積極發(fā)帖幫助解答問題。 2013-02-01 21:13:08
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amisking: 金幣+3, MolEPI+1, 鼓勵積極發(fā)帖幫助解答問題。 2013-02-01 21:13:08
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在此想請問一個問題，樓主在擴增這個相關(guān)基因時設(shè)計的引物是剛好從起始密碼子或終止密碼子設(shè)計的？ 在我們實驗室，一般認為測序結(jié)果中前面80-100bp的測序結(jié)果是不準確的。不知道樓主那里的測序是不是從第一個堿基到最后一個堿基都保證是準確的？ 遇到這樣的問題，應(yīng)該先去查一查測序結(jié)果中的ABI文件中堿基讀取峰圖。 看樓主上面說的似乎沒有查證過。 如果峰型很好，說明測序公司給你的測序結(jié)果是準確的。 那么考慮是否真的發(fā)生了突變？ 一般來說590bp一個反應(yīng)足夠了 還有要考慮的是PCR擴增的過程中是有一定的幾率錯配的 希望能幫到樓主吧，知道的也就這么多啦。。。 |
2樓2013-02-01 20:15:50
longyh6411
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longyh6411
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5樓2013-02-01 22:22:29
【答案】應(yīng)助回帖
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longyh6411: 金幣+50, ★★★很有幫助, 我也比較傾向于引物的問題，謝謝大家的解答 2013-02-03 10:39:41
longyh6411: 金幣+50, ★★★很有幫助, 我也比較傾向于引物的問題，謝謝大家的解答 2013-02-03 10:39:41
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你發(fā)給引物合成公司的序列是一樣的，但是即使是同一管引物也包含了無數(shù)的寡核苷酸鏈分子，合成中不管是哪一種純化方式都無法保證所有的寡核苷酸分子是完全和你所發(fā)的序列是一樣的，就是有那么一些分子是有差錯的，所以這種不同正巧出現(xiàn)在你的兩次PCR中，其實即使是同一次PCR的不同克隆也很有可能會出現(xiàn)這種情況，原因就在于那一管引物粉末中不是所有的引物分子都是完全忠實于你所發(fā)的引物序列。 請LZ仔細分析下你的問題會不會是這種情況。如果是這樣的話，必須重新設(shè)計更下游的引物來得到這一段的真實序列，因為拿這一段來設(shè)計引物測序得到的都只能是引物自己的序列。 |
6樓2013-02-01 23:16:25
rola
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7樓2013-02-02 10:58:41
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8樓2013-02-02 17:03:25
9樓2013-02-04 11:51:08
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