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longyh6411金蟲 (小有名氣)
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[求助]
測序結(jié)果很奇怪
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我用A和B是同一物種，該物種的基因組數(shù)據(jù)早就出來了，而且是用A測得的。A和B在我研究的性狀上有很大不同。我P了A和B的與這個(gè)形狀相關(guān)的一個(gè)相關(guān)基因，片段不大，只有590bp，但是奇怪的事出來了，在3‘的(下游引物結(jié)合區(qū)域內(nèi),而且在做PCR的時(shí)候A和B用的是統(tǒng)一管引物)端A和B序列有l(wèi)兩個(gè)堿基比對不上，而且A和數(shù)據(jù)庫也比對不上，有一個(gè)堿基的缺失另外一個(gè)堿基的突變。更關(guān)鍵的就是A的序列這個(gè)與B比對不上的堿基形成了終止密碼子。也就是說和數(shù)據(jù)庫相比終止密碼子出現(xiàn)的提前了，也就導(dǎo)致了最后好幾個(gè)氨基酸的缺失。 請問這是否是由于下游引物有問題呢還是可能是本身的突變?590單向測序可靠不？以前測了很多序列都沒出現(xiàn)這樣的問題，求高手幫忙 我只做了正向測序，測序是用的PCR產(chǎn)物 [ Last edited by longyh6411 on 2013-2-1 at 18:33 ] |
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 【分子生物】EPI帖 |
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longyh6411
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5樓2013-02-01 22:22:29
chiden
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【答案】應(yīng)助回帖
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在此想請問一個(gè)問題，樓主在擴(kuò)增這個(gè)相關(guān)基因時(shí)設(shè)計(jì)的引物是剛好從起始密碼子或終止密碼子設(shè)計(jì)的？ 在我們實(shí)驗(yàn)室，一般認(rèn)為測序結(jié)果中前面80-100bp的測序結(jié)果是不準(zhǔn)確的。不知道樓主那里的測序是不是從第一個(gè)堿基到最后一個(gè)堿基都保證是準(zhǔn)確的？ 遇到這樣的問題，應(yīng)該先去查一查測序結(jié)果中的ABI文件中堿基讀取峰圖。 看樓主上面說的似乎沒有查證過。 如果峰型很好，說明測序公司給你的測序結(jié)果是準(zhǔn)確的。 那么考慮是否真的發(fā)生了突變？ 一般來說590bp一個(gè)反應(yīng)足夠了 還有要考慮的是PCR擴(kuò)增的過程中是有一定的幾率錯(cuò)配的 希望能幫到樓主吧，知道的也就這么多啦。。。 |
2樓2013-02-01 20:15:50
longyh6411
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3樓2013-02-01 21:51:24
4樓2013-02-01 22:03:43
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