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hakkie新蟲 (初入文壇)
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[求助]
Real time 加樣問題！ 已有7人參與
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最近做real time， 用的10u的體系，加樣順序：（Sybr Green Master Mix+H2O（共7u））*n，加樣；（引物Mix2u+cDNA1u）*n，混勻，加樣。三個(gè)平行孔，結(jié)果三個(gè)孔的反應(yīng)結(jié)果相差很大，Ct值差距最大為3！也就是說加樣誤差很大。加引物Mix時(shí)一樣的引物沒有換槍頭，cDNA也一樣，不知道有沒有這樣加的，這樣會(huì)有多大的誤差？ 如果引物Mix和cDNA分開加，又使加樣過程很繁瑣，不僅容易出錯(cuò)，個(gè)人覺得加1u cDNA，等加到最后一孔了，第一個(gè)孔的cDNA是不是會(huì)已經(jīng)蒸發(fā)掉一些。。。 另外加完Sybr Green Master Mix和水后，再加引物和模板時(shí)是加的壁上好，還是直接加進(jìn)反應(yīng)液里？覺得直接加進(jìn)反應(yīng)液誤差小，但容易有氣泡，離心也難去除。 |
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 QPCR 問題簡答 |
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