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[交流]
鎳柱有很多雜蛋白是緩沖液的問(wèn)題還是什么問(wèn)題？ 已有6人參與
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可溶性蛋白的純化 1） 平衡緩沖液：pH7.4的50mM磷酸緩沖液含0.5M NaCl，含20mM咪唑。 2） 洗脫緩沖液：pH7.4的50mM磷酸緩沖液含0.5M NaCl，含500mM咪唑。 3） 取1ml鎳瓊脂糖凝膠FF或鎳NTA瓊脂糖凝膠FF預(yù)裝柱，用10ml平衡緩沖液平衡，然后取破碎上清10ml樣品以0.5ml/min上樣，然后2ml/管分管收集。 4） 用15ml平衡緩沖液洗去未吸附的樣品，流速1-2ml/min，2ml/管收集。 5） 用5 ml洗脫緩沖液洗去未吸附的樣品，流速1-2ml/min，2ml/管收集。 6） 再用5ml平衡緩沖液平衡柱子，灌滿20%乙醇，封閉。 這些是我實(shí)驗(yàn)用到的，可以鎳柱純化效果還是不理想，雜蛋白，怎么辦？ |
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3樓2014-10-09 16:30:11
wolfman840
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你的洗脫緩沖液含咪唑的濃度需要摸索，按你的說(shuō)法，是直接洗脫了。你可以試試梯度洗脫。方法如下 1.平衡，用10ml平衡buffer沖洗鎳柱。0.5ml/min，收集，1ml/管。 2.load，樣品用0.25ml/min流速，上樣。最好上樣前測(cè)一下你的蛋白吸光度，在穿過(guò)液中再測(cè)一下。如果達(dá)到10%上樣吸光度，就不要上了。（前提是你有在線監(jiān)測(cè)UV的） 3.平衡，用10ml平衡buffer沖洗鎳柱，0.5ml/min，收集，1ml/管。 4.洗脫，用20ml洗脫buffer以0.5ml/min流速進(jìn)行線性洗脫。1ml/管收集。檢測(cè)你的目的蛋白，收集純度較高的一段。 5.再生。5ml洗脫buffer以0.25ml/min流速清洗柱子后，立即用平衡buffer沖洗20ml。加20%乙醇，封閉。 |
2樓2014-10-08 14:22:56
super_mm
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4樓2014-10-11 10:39:54
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5樓2014-10-11 17:50:39
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