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[求助]
小白求助基因克隆步驟 已有2人參與
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| 如果已知一個物種的某段基因的序列，怎樣利用生物信息學方法，克隆到與該物種同源的另一個物種的具有相同功能的基因。具體步驟該怎么做，我blast了一下，就找到一個目的物種與其同源的基因序列，接下來該怎么設(shè)計引物呢，用到哪些軟件麻煩都告訴我一下，不要求具體操作，但是希望能告知大體流程。如果順利多長時間可以拿到該基因，功能驗證的話應(yīng)該怎么驗證，要花多長時間大概，也希望告知。功能驗證能不能利用northern blot驗證呢，該基因是與根尖分裂有關(guān)的，想著看一下干旱脅迫后該基因的表達情況能行么。 |
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nwsuafliu
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【答案】應(yīng)助回帖
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感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
kx444555: 鼓勵交流 2014-10-13 09:05:53
瘋狂的麥子: 金幣+1, ★★★很有幫助 2014-10-13 11:25:44
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簡單的流程如下，你既然已經(jīng)知道這個基因的序列，那么如下操作便可。 1 設(shè)計引物�？梢允褂密浖䅟rimer6, oligo6.或者使用Primer3在線設(shè)計工具。我個人習慣使用primer3的在線設(shè)計 2 PCR擴增 - 膠回收 、純化 - 連接反應(yīng) - 轉(zhuǎn)化大腸桿菌（DH5a) - 提取質(zhì)粒 - 測序驗證序列正確性。 3 表達載體構(gòu)建。把步驟2得到的基因片段轉(zhuǎn)入植物表達載體，例如pCAMBIA1301. 4 植物遺傳轉(zhuǎn)化。農(nóng)桿菌介導得到轉(zhuǎn)基因苗。 5 查看表型。 如果只是看脅迫條件下的表達，那么直接根據(jù)cDNA序列設(shè)計引物，采集對照條件和脅迫條件下的根、葉樣品，提取RNA，進行RT-PCR即可，可半定量或者定量。 |
2樓2014-10-13 08:48:17
3樓2014-10-13 10:12:12
nwsuafliu
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7樓2014-10-14 09:47:57
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我還有一個問題不太懂現(xiàn)在，我利用實時熒光定量測定的是不同干旱時間處理后的該基因的表達量，該基因可能對根尖細胞分生組織的細胞分裂有關(guān)，突變體會影響初生根和不定根的伸長，這是別人在水稻上驗證了的，我想在大麥中看看該基因的表達量與幼苗根系形態(tài)建成的影響或者是兩者之間的關(guān)系。這樣的邏輯通么？就是說基因表達量能不能夠說明形態(tài)上出現(xiàn)的差異呢，根系形態(tài)我想從根長，根表面積，根尖數(shù)量以及各種顯微結(jié)構(gòu)來說明，有沒有說服力呢？昨天有人跟我說要找到該基因控制的蛋白，從蛋白上說明問題，有沒有這個必要呢，我只是想初步看看兩者之間的影響，做一下。邏輯上說的通么？望解答，實在不好意思。 |
8樓2014-10-15 17:43:53
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9樓2014-10-15 23:05:29
10樓2015-06-25 22:16:54
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