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[求助]
小白求助基因克隆步驟 已有2人參與
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| 如果已知一個(gè)物種的某段基因的序列，怎樣利用生物信息學(xué)方法，克隆到與該物種同源的另一個(gè)物種的具有相同功能的基因。具體步驟該怎么做，我blast了一下，就找到一個(gè)目的物種與其同源的基因序列，接下來(lái)該怎么設(shè)計(jì)引物呢，用到哪些軟件麻煩都告訴我一下，不要求具體操作，但是希望能告知大體流程。如果順利多長(zhǎng)時(shí)間可以拿到該基因，功能驗(yàn)證的話應(yīng)該怎么驗(yàn)證，要花多長(zhǎng)時(shí)間大概，也希望告知。功能驗(yàn)證能不能利用northern blot驗(yàn)證呢，該基因是與根尖分裂有關(guān)的，想著看一下干旱脅迫后該基因的表達(dá)情況能行么。 |
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我還有一個(gè)問(wèn)題不太懂現(xiàn)在，我利用實(shí)時(shí)熒光定量測(cè)定的是不同干旱時(shí)間處理后的該基因的表達(dá)量，該基因可能對(duì)根尖細(xì)胞分生組織的細(xì)胞分裂有關(guān)，突變體會(huì)影響初生根和不定根的伸長(zhǎng)，這是別人在水稻上驗(yàn)證了的，我想在大麥中看看該基因的表達(dá)量與幼苗根系形態(tài)建成的影響或者是兩者之間的關(guān)系。這樣的邏輯通么？就是說(shuō)基因表達(dá)量能不能夠說(shuō)明形態(tài)上出現(xiàn)的差異呢，根系形態(tài)我想從根長(zhǎng)，根表面積，根尖數(shù)量以及各種顯微結(jié)構(gòu)來(lái)說(shuō)明，有沒(méi)有說(shuō)服力呢？昨天有人跟我說(shuō)要找到該基因控制的蛋白，從蛋白上說(shuō)明問(wèn)題，有沒(méi)有這個(gè)必要呢，我只是想初步看看兩者之間的影響，做一下。邏輯上說(shuō)的通么？望解答，實(shí)在不好意思。 |
8樓2014-10-15 17:43:53
nwsuafliu
木蟲 (著名寫手)
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【答案】應(yīng)助回帖
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感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
kx444555: 鼓勵(lì)交流 2014-10-13 09:05:53
瘋狂的麥子: 金幣+1, ★★★很有幫助 2014-10-13 11:25:44
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瘋狂的麥子: 金幣+1, ★★★很有幫助 2014-10-13 11:25:44
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簡(jiǎn)單的流程如下，你既然已經(jīng)知道這個(gè)基因的序列，那么如下操作便可。 1 設(shè)計(jì)引物�？梢允褂密浖䅟rimer6, oligo6.或者使用Primer3在線設(shè)計(jì)工具。我個(gè)人習(xí)慣使用primer3的在線設(shè)計(jì) 2 PCR擴(kuò)增 - 膠回收 、純化 - 連接反應(yīng) - 轉(zhuǎn)化大腸桿菌（DH5a) - 提取質(zhì)粒 - 測(cè)序驗(yàn)證序列正確性。 3 表達(dá)載體構(gòu)建。把步驟2得到的基因片段轉(zhuǎn)入植物表達(dá)載體，例如pCAMBIA1301. 4 植物遺傳轉(zhuǎn)化。農(nóng)桿菌介導(dǎo)得到轉(zhuǎn)基因苗。 5 查看表型。 如果只是看脅迫條件下的表達(dá)，那么直接根據(jù)cDNA序列設(shè)計(jì)引物，采集對(duì)照條件和脅迫條件下的根、葉樣品，提取RNA，進(jìn)行RT-PCR即可，可半定量或者定量。 |
2樓2014-10-13 08:48:17
3樓2014-10-13 10:12:12
nwsuafliu
木蟲 (著名寫手)
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【答案】應(yīng)助回帖
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瘋狂的麥子(西門吹雪170代發(fā)): 金幣+2, 鼓勵(lì)回帖交流 2014-10-14 10:51:26
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這個(gè)好辦。你有了水稻的序列，那么通過(guò)blastn，就可以得到大麥中的同源基因的序列。你可以去大麥基因組數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行blast。 得到大麥基因序列以后，根據(jù)其序列來(lái)設(shè)計(jì)引物，用大麥的DNA作為模板進(jìn)行擴(kuò)增。 如果你只是看這個(gè)基因是否響應(yīng)干旱脅迫，就不需要克隆它了。只需要根據(jù)該基因的cDNA序列設(shè)計(jì)引物，進(jìn)行RT-PCR。 |
4樓2014-10-13 11:29:11
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