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yajune木蟲 (職業(yè)作家)
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[求助]
熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線的問題 已有2人參與
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投了篇毒理學(xué)的文章，審稿人提出了關(guān)于熒光定量PCR的優(yōu)化問題，我的QPCR就是按照試劑盒進(jìn)行的，就是所有測(cè)的基因都按照一個(gè)擴(kuò)增方法（試劑盒推薦的）就都能擴(kuò)出來，所以可能也不需要優(yōu)化吧。但是關(guān)于標(biāo)準(zhǔn)曲線的問題，我有點(diǎn)不明白，我的QPCR做的是相對(duì)定量，也就是把對(duì)照組當(dāng)作1，然后計(jì)算處理組的相對(duì)表達(dá)值；這種半定量也需要標(biāo)準(zhǔn)曲線么？還是說審稿人指的是擴(kuò)增曲線呢？下邊是審稿人的原話，麻煩比較懂得同學(xué)幫我分析一下，謝謝啦 How were the QPCR assays optimised: no details are currently given and the authors state everything was run at the same temperature. What was the efficiency and correlation coefficient for the standard curves in each case? If appropriate validation was not conducted the dataset is not valid. If this was conducted, please add details to the supplemental table. 另外審稿人還提了一個(gè)選擇內(nèi)參基因的問題，我用的是beta-actin，但是審稿人貌似覺得這個(gè)內(nèi)參不合適。。。問我是如何證明它的表達(dá)是穩(wěn)定的，這個(gè)問題我還真沒考慮過，因?yàn)槲沂强创蟛糠治墨I(xiàn)都以beta-actin為內(nèi)參，我就理所當(dāng)然的用了這個(gè)，請(qǐng)問一下這個(gè)問題從技術(shù)上講有比較好的解決辦法么？或者說有什么比較好的回答方法么？ |
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zhangyunjing
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【答案】應(yīng)助回帖
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yajune(西門吹雪170代發(fā)): 金幣+2, 鼓勵(lì)回帖交流 2014-10-16 14:58:15
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yajune(西門吹雪170代發(fā)): 金幣+2, 鼓勵(lì)回帖交流 2014-10-16 14:58:15
| 做相對(duì)定量需要制備標(biāo)準(zhǔn)曲線，標(biāo)準(zhǔn)曲線的目的是證明你的兩個(gè)基因擴(kuò)增效率差不多，這主要有標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率，相關(guān)系數(shù)和擴(kuò)增效率來證明的，如果你的兩個(gè)基因的擴(kuò)增效率差別很大，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)是不可靠的 |
3樓2014-10-16 10:16:44
xiemin217
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2樓2014-10-16 10:04:19
yajune
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4樓2014-10-17 01:36:25
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