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[求助]
cDNA，3.5Kb 擴(kuò)增不出來 已有2人參與
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| 用玉米葉片提取RNA并反轉(zhuǎn)錄為CDNA，我需要擴(kuò)增的片段為3.52Kb,包括5‘UTR區(qū)。做PCR一直跑不出來，一條帶也沒有。引物的退火溫度都是66度以上的，跑程序時(shí)退火溫度設(shè)置為55-62度，這區(qū)間的都試了還是沒有結(jié)果，求各位同仁們指導(dǎo)，謝謝！可否按照KOD酶的兩步法跑PCR。 |
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5樓2015-05-08 15:55:40
【答案】應(yīng)助回帖
★
感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
myprayer: 金幣+1, 贈(zèng)人玫瑰手有余香，分子生物期待你更多精彩。 2015-01-12 23:00:19
感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
myprayer: 金幣+1, 贈(zèng)人玫瑰手有余香，分子生物期待你更多精彩。 2015-01-12 23:00:19
| 今天遇到兩個(gè)做玉米的同行了。你這個(gè)問題我也曾遇到過。慢慢摸索。建議先換酶，3.5kb可以先試試LA taq。玉米本身基因組結(jié)構(gòu)比較復(fù)雜，有很多的轉(zhuǎn)座子，延伸延伸時(shí)間，再試試。另外，看看你擴(kuò)增的片段的GC含量，這個(gè)問題曾經(jīng)困擾過我，后來換用GC buffer解決了這個(gè)問題。祝你好運(yùn)。 |
2樓2015-01-12 21:52:40
3樓2015-01-12 23:41:51
4樓2015-01-12 23:47:45
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