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1樓 2015-02-10 13:13:56

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九字江山

銀蟲 (小有名氣)

應(yīng)助: 9 (幼兒園)
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專業(yè): 生物化學(xué)

【答案】應(yīng)助回帖

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sxjcas: 金幣+10, ★★★很有幫助 2015-02-15 19:56:17

蛋白保存應(yīng)根據(jù)對活性的要求及蛋白的種類而定：抗體:除非一些公司特別要求-20℃凍存，一般4℃可穩(wěn)定一年（無菌，如加疊氮鈉），因?yàn)榭贵w是一種具有非常穩(wěn)定結(jié)構(gòu)的蛋白；要求具有活性的蛋白,最好根據(jù)需要小量保存4℃(一周）、-20℃(一個(gè)月)、-80℃(六個(gè)月)、液氮（基本無限期），反復(fù)凍融會導(dǎo)致諸多不良后果，如聚集、修飾、降解、污染等（取決于蛋白濃度、緩沖液成分及蛋白本身的特點(diǎn)）；凍干是一種很好的長期保存法（如條件具備），在大多數(shù)情況下可以很好地保存蛋白的活性，但不適于某些蛋白（因有些蛋白對凍干重溶時(shí)必然產(chǎn)生的鹽離子濃度的急劇變化反應(yīng)不佳，其活性會永久喪失（應(yīng)具體對待，尚無規(guī)律可循）。另：蛋白聚集與二硫鍵形成是兩個(gè)概念，巰基乙醇只負(fù)責(zé)維持-SH的游離狀態(tài)，形成二硫鍵是一化學(xué)反應(yīng)，產(chǎn)生純凈物，聚集一般只通過一些離子鍵、范德華力、疏水力形成，可以用物理方法分開。較長時(shí)間的保存最好用DTT。在加入緩沖液中24小時(shí)內(nèi)，巰基乙醇被氧化，其后可加速蛋白的失活，而DTT不危及蛋白質(zhì)的巰基。因此，最好是在制備蛋白質(zhì)樣品的時(shí)候用大約12mmol/L巰基乙醇，而長期儲存則使用1-5mmol/L的DTT。（見《蛋白質(zhì)技術(shù)手冊》）另外，我有印象看產(chǎn)品目錄的時(shí)候，看到有一種用于western的試劑盒，提供的試劑可以在還原二硫鍵之后在巰基上烷基化，這樣就防止了二硫鍵的再次生成。抗體儲存容器應(yīng)由不吸附蛋白質(zhì)的材料制成，常用的有聚丙烯，聚碳酸酯和硼硅酸玻璃。如儲存的抗體中蛋白濃度很低（10-100Mg/L），就應(yīng)另加隔離蛋白以減少容器對抗體蛋白的吸附，隔離蛋白常用0.1%-1.0%的牛血清白蛋白。絕大多數(shù)已稀釋的抗體應(yīng)存在4℃-8℃條件下，以免凍融對抗體蛋白產(chǎn)生有害效應(yīng)�？贵w原液和已分離的免疫球蛋白組分應(yīng)保存于-20℃條件下，并避免反復(fù)凍融。冷凍的抗體溶液應(yīng)置于室溫中緩慢地解凍，應(yīng)絕對避免用高溫快速解凍。被細(xì)菌污染的抗體常會出現(xiàn)假陽性結(jié)果，應(yīng)將污染的抗體溶液及其他試劑

棄之。為防止細(xì)菌污染，可于抗體溶液中加入0.01%疊氮鈉。抗體經(jīng)真空冷凍干燥后置-20℃以下可保存3-5年。保存稀釋后的單抗應(yīng)加入0.1%疊氮鈉濃度。大多數(shù)稀釋抗體可進(jìn)行冷凍保存，少數(shù)抗體可能會丟失抗原活性。大多數(shù)單抗，只要蛋白濃度適當(dāng)，可在4℃下保存數(shù)月。其他注意事項(xiàng)：分裝可以最大程度的降低反復(fù)凍融對抗體活性的損害，同時(shí)也降低了由于多次從同一管中吸取抗體造成的污染可能性。分裝的量以一次實(shí)驗(yàn)用完為好，最少不能少于10ul每份。因?yàn)榉盅b體積越小，抗體的濃度越可能會受到蒸發(fā)以及管壁吸附的影響。復(fù)融后的分裝抗體如果一次用不完，將剩余母液保存在4℃，避免再凍起來！抗體工作液應(yīng)該當(dāng)天配制當(dāng)天用完，在4℃ 盡量不要超過1天。絕對避免將抗體保存在自動(dòng)除霜冰箱中。盡量將抗體保存在冰箱里層，而不是門上。無論是保存還是運(yùn)輸，絕對避免反復(fù)凍融！反復(fù)凍融會導(dǎo)致抗體變性，導(dǎo)致多聚體形成，從而降低抗體的結(jié)合能力！蛋白在高濃度時(shí)更不容易降解（1 mg/ml 或者更高），這就是為什么在抗體中加入BSA之類作為穩(wěn)定劑的原因了；另一方面，加入的蛋白也可以減少抗體由于管壁吸附所造成的損失。但是如果抗體要用來標(biāo)記的話，則不能加入蛋白穩(wěn)定劑，因?yàn)檫@些穩(wěn)定劑會和抗體一起競爭結(jié)合標(biāo)記物。為了防止微生物污染，疊氮化鈉經(jīng)常被加入到抗體中（終濃度0.02% (w/v)）。疊氮化鈉會干擾任何含有氨基基團(tuán)的偶聯(lián)，因此在進(jìn)行偶聯(lián)之前，應(yīng)將疊氮化鈉去除。偶聯(lián)后的抗體可以加入疊氮化鈉保存，但是濃度只能是0.01％。對于需要偶聯(lián)的抗體，thimerosal (merthiolate)可以替代疊氮化鈉作為保護(hù)劑！注：疊氮化鈉的去除方式：可以通過凝膠電泳或過濾的方式去除！IgG的分子量是150kDa (IgM 是~ 600kDa); 疊氮化鈉的分子量只有65Da。使用cut off 14kDa的濾膜即可將疊氮化鈉從抗體中去除。純化IgG: 不要保存稀釋的抗體,高濃度有利于保存。IgG會粘附于玻璃或塑料，低于0.1mg/ml的蛋白會很快被吸收并變性失去活性。

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回復(fù)此樓

2樓2015-02-15 10:07:19

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sxjcas

禁蟲 (知名作家)

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3樓2015-02-15 19:36:51

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