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[求助]
PCR就是P不出目的片段，急急急！ 已有4人參與
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我的目的片段：GTGTCAGTCGAGACTAGGAAGATCA CCAAGGTTCTTGTCGCTAACCGTGGTGAGATTGCAATCCGCGT…………TGTTCTCC TCGAGATCAAGTAA（1776bp）。我的引物:上CCTACAATCTTTAGAGGAGACACAAC GTGTCAGTCGAGACTAGGAAGATCA，下TGCTCTAGA TTACTTGATCTCGA。 PCR條件1：95度30秒 2: 55度、58度，60度都試過，15秒 3:72度2分30秒 就是P不出目的片段，不知道到底哪里出錯了，求救�。。�！ |
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2樓2015-03-18 09:06:13
3樓2015-03-18 09:07:14
4樓2015-03-18 09:09:53
5樓2015-03-18 09:14:20
6樓2015-03-18 09:30:54
zhangyunjing
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【答案】應(yīng)助回帖
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感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
ngd2013: 金幣+5, ★有幫助, 先感謝，我又學(xué)到了東西 2015-03-18 16:07:45
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ngd2013: 金幣+5, ★有幫助, 先感謝，我又學(xué)到了東西 2015-03-18 16:07:45
| 從對你的上下游引物分析的結(jié)果來看，理論上講你這樣的引物設(shè)計確實擴增不出目的條帶。引物設(shè)計時正反向引物的Tm差別在5℃以內(nèi)，與模板結(jié)合的上游引物的Tm為61℃，引物長度為25 bp;與模板結(jié)合的下游引物的Tm才39℃，長度為14 bp，所以你用55℃退火擴增不出來是正常的；建議你下游引物與模板結(jié)合的部分設(shè)計長一點，Tm在61℃左右。特別注意的是計算引物的退火溫度時只能按照與模板互補那部分，不互補的是不能算進去的 |
7樓2015-03-18 11:19:17
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8樓2015-03-19 14:59:13
9樓2015-03-19 15:05:56
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