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[求助]
PCR就是P不出目的片段，急急急！ 已有4人參與
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我的目的片段：GTGTCAGTCGAGACTAGGAAGATCA CCAAGGTTCTTGTCGCTAACCGTGGTGAGATTGCAATCCGCGT…………TGTTCTCC TCGAGATCAAGTAA（1776bp）。我的引物:上CCTACAATCTTTAGAGGAGACACAAC GTGTCAGTCGAGACTAGGAAGATCA，下TGCTCTAGA TTACTTGATCTCGA。 PCR條件1：95度30秒 2: 55度、58度，60度都試過，15秒 3:72度2分30秒 就是P不出目的片段，不知道到底哪里出錯(cuò)了，求救�。。�！ |
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zhangyunjing
金蟲 (小有名氣)
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【答案】應(yīng)助回帖
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感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
ngd2013: 金幣+5, ★有幫助, 先感謝，我又學(xué)到了東西 2015-03-18 16:07:45
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| 從對(duì)你的上下游引物分析的結(jié)果來看，理論上講你這樣的引物設(shè)計(jì)確實(shí)擴(kuò)增不出目的條帶。引物設(shè)計(jì)時(shí)正反向引物的Tm差別在5℃以內(nèi)，與模板結(jié)合的上游引物的Tm為61℃，引物長度為25 bp;與模板結(jié)合的下游引物的Tm才39℃，長度為14 bp，所以你用55℃退火擴(kuò)增不出來是正常的；建議你下游引物與模板結(jié)合的部分設(shè)計(jì)長一點(diǎn)，Tm在61℃左右。特別注意的是計(jì)算引物的退火溫度時(shí)只能按照與模板互補(bǔ)那部分，不互補(bǔ)的是不能算進(jìn)去的 |
7樓2015-03-18 11:19:17
2樓2015-03-18 09:06:13
3樓2015-03-18 09:07:14
4樓2015-03-18 09:09:53
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