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lxyyzz木蟲 (小有名氣)
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[求助]
菌液PCR無(wú)陽(yáng)性條帶求助！ 已有4人參與
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RT，分子克隆鑒定的時(shí)候進(jìn)行菌液PCR，無(wú)陽(yáng)性條帶，后來(lái)陽(yáng)性對(duì)照實(shí)驗(yàn)如下： 1. 用原始質(zhì)粒DNA做模板進(jìn)行PCR，有條帶 2. 用原始質(zhì)粒的甘油菌做模板進(jìn)行PCR，無(wú)條帶！ 說(shuō)明整個(gè)菌液PCR過(guò)程有問(wèn)題，包含原始質(zhì)粒的菌液都無(wú)法出現(xiàn)陽(yáng)性條帶。 求助各位可能是哪方面的問(wèn)題？ （菌液PCR使用2X Taq mix， 使用程序第一步為熱變性，95度10分鐘和20分鐘兩個(gè)條件我都試過(guò)，但原始質(zhì)粒的菌液PCR都沒(méi)有條帶） |
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lxyyzz: 金幣+2, ★有幫助, 我感覺是菌液的DNA沒(méi)有釋放出來(lái)，因?yàn)橛觅|(zhì)粒DNA做模板是可以做出條帶的啊 2015-03-31 09:37:08
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lxyyzz: 金幣+2, ★有幫助, 我感覺是菌液的DNA沒(méi)有釋放出來(lái)，因?yàn)橛觅|(zhì)粒DNA做模板是可以做出條帶的啊 2015-03-31 09:37:08
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第一，菌用量多了或者少了都會(huì)p不出來(lái)，第二，其實(shí)不用熱變性10分鐘，我一般做5分鐘，不過(guò)最好用熱啟動(dòng)酶，第三，換更高效的酶，如果可以的話我建議用kapa的2g robust hotstart mix，1k以下的片段從來(lái)沒(méi)有失敗過(guò) [ 發(fā)自手機(jī)版 http://www.gaoyang168.com/3g ] |
2樓2015-03-31 08:53:53
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lxyyzz: 金幣+3, ★★★很有幫助, 1. 是普通的Taq聚合酶 2. 除了模板不同之外條件一摸一樣，是預(yù)混后分裝的 3. 無(wú)條帶的意思是目標(biāo)條帶、雜帶都沒(méi)有 2015-03-31 09:39:24
| 2乘Taq mix 是普通的Taq DNA聚合酶吧？？預(yù)變性盡然用95℃10-20min？一般的酶變性沒(méi)有這么長(zhǎng)時(shí)間啊，一般只有用化學(xué)修飾或者抗體修飾的的熱啟動(dòng)聚合酶才需要10min吧，你這有條帶和無(wú)條帶，除了模板不同之外其他反應(yīng)試劑條件都是一樣的嗎？無(wú)條帶是沒(méi)有目的條帶出來(lái)那有沒(méi)有雜帶呢，也沒(méi)說(shuō)啊 |
3樓2015-03-31 09:02:37
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4樓2015-03-31 09:23:01
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6樓2015-03-31 11:12:11
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7樓2015-03-31 13:15:55
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lxyyzz: 金幣+3, ★有幫助, 1. 我的引物大概40bp左右，菌落PCR不能用長(zhǎng)引物是什么原理呢？與質(zhì)粒PCR有什么不同呢 2. 本來(lái)設(shè)計(jì)的煮樣10min是讓細(xì)菌裂解，使得DNA釋放出來(lái)作為模板 3. MIX使用的時(shí)候是稀釋為1X的才用的 2015-03-31 20:43:19
lxyyzz: 金幣+1, ★★★★★最佳答案, 確實(shí)是引物的問(wèn)題。我換了一個(gè)短一些的就P出來(lái)了，看來(lái)是菌液模板太復(fù)雜，引物特異性不行的結(jié)果。非常感謝！ 2015-04-01 14:16:47
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lxyyzz: 金幣+1, ★★★★★最佳答案, 確實(shí)是引物的問(wèn)題。我換了一個(gè)短一些的就P出來(lái)了，看來(lái)是菌液模板太復(fù)雜，引物特異性不行的結(jié)果。非常感謝！ 2015-04-01 14:16:47
| 你的引物長(zhǎng)度多少？菌落pcr不能用長(zhǎng)引物的；另外taq的話預(yù)變性5min足矣；mix用1*吧，干嘛用2*的呢？ |
8樓2015-03-31 17:14:26
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