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hajierlove銅蟲 (正式寫手)
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[求助]
菌液pcr,坐等求助 已有7人參與
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| 今天做的菌液pcr，三個(gè)基因挑了48個(gè)單克隆，做菌液pcr，引物是M13通用引物，出來的目的條帶都是250bp。750bp。目的片段是500bp。怎么回事？只能證明沒有連接上嗎？ |
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凌波麗
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【答案】應(yīng)助回帖
★ ★ ★ ★ ★
西門吹雪170: 金幣+5, MolEPI+1, 鼓勵(lì)回帖交流 2014-07-24 09:32:22
西門吹雪170: 金幣+5, MolEPI+1, 鼓勵(lì)回帖交流 2014-07-24 09:32:22
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個(gè)人意見，剛寫出來的，邊想邊寫，可能有錯(cuò)，僅供參考。 菌液PCR的假陽性的原因和解決方法(凌波麗，2014年7月24日) 1.建議樓主做陰性對照，陽性對照，檢查是否存在污染。 2.假陽性可能的來源是未能和載體連接上的插入片段，這不相當(dāng)于普通PCR的模板提取的那一步，這步的關(guān)鍵可能是保證挑的細(xì)菌克隆的確都能保證是陽性克隆。 3.菌液PCR假陽性也可能是引物設(shè)計(jì)有問題，引起不專一性PCR擴(kuò)增。 4.可以加強(qiáng)DNA聚合酶的專一性（這步和普通PCR相同）： （1）Taq DNA聚合酶的專一性擴(kuò)增不夠。改用專一性更強(qiáng)的DNA聚合酶，或者使用兩種不同的DNA聚合酶，減低酶量或調(diào)換另一來源的專一性高的酶。更換DNA聚合酶時(shí)，酶量不要太大，以免出現(xiàn)特異性擴(kuò)增。 （2）酶制劑中的甘油可能也是干擾因素�？梢约尤刖篜CR反應(yīng)體系之前用超濾去除酶制劑中的甘油。 （3）在反應(yīng)體系中加入：1.0mol/L的甜菜堿或者5%的DMSO可以提高PCR擴(kuò)增效率，兩者可以穩(wěn)定 DNA聚合酶。 5.是否存在菌液PCR的反應(yīng)體系之外的DNA污染源 菌液PCR的反應(yīng)體系被污染：這種污染有兩種原因： 第一種可能：大片段的交叉污染，導(dǎo)致非特異性帶出現(xiàn)。 這種非特異性帶出現(xiàn)可用以下方法解決： （1）在加樣槍的接頭和吸桿之間加上脫脂消毒棉花，防止以前操作時(shí)將其他的DNA靶序列吸入加樣槍內(nèi)。 （2）除了酶及不能耐高溫的物質(zhì)外，所有試劑或器材均應(yīng)高壓消毒。 （3）所用離心管及樣進(jìn)槍頭等均應(yīng)一次性使用。必要時(shí)，在加標(biāo)本前，反應(yīng)管和試劑用紫外線照射，以破壞存在的核酸。 第二種可能：空氣中的小片段核酸污染，這些小片段比靶序列短，但有一定的同源性。有時(shí)候可能會(huì)互相拼接，與引物互補(bǔ)后，可擴(kuò)增出PCR產(chǎn)物，而導(dǎo)致非特異性帶出現(xiàn)的產(chǎn)生。雖然這樣的可能性比較小。 對策：實(shí)驗(yàn)前對實(shí)驗(yàn)室充分通風(fēng)，試驗(yàn)時(shí)盡量加上PCR試劑暴露于空氣中的時(shí)間。 6.反應(yīng)體系過大，模板DNA和非模板DNA過多引起了非特異性擴(kuò)增。 7.目的DNA模板可能本身存在某些問題，比如與一些蛋白質(zhì)發(fā)生了較牢固的結(jié)合（特異性或者非特異性）-----因?yàn)榧?xì)菌也有類核，而這樣的結(jié)合在裂解細(xì)菌由于某些因素沒有去除，或者目的DNA模板的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)有某些問題。第7點(diǎn)只是我從細(xì)菌分子生物學(xué)角度做的猜測。第7條成為原因的可能性極小。 因?yàn)槿绻舻年栃钥寺]有問題，同時(shí)PCR的引物也肯定能夠與目的模板互補(bǔ)的話，那么出現(xiàn)目的DNA擴(kuò)增片段應(yīng)該不是問題，也可能有非特異性擴(kuò)增存在，但是只有非特異性擴(kuò)增的話，所以此時(shí)就要考慮什么原因阻止了目的DNA的擴(kuò)增。 8.引物的特異性差，受非特異性的PCR擴(kuò)增的競爭性抑制作用的影響，靶基因的PCR擴(kuò)增效率低，特異性的PCR產(chǎn)物極少。第1條措施到第6條措施均無效，則必須考慮重新設(shè)計(jì)引物。 |
8樓2014-07-24 02:25:30
【答案】應(yīng)助回帖
★ ★ ★
感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
hajierlove(西門吹雪170代發(fā)): 金幣+3, 鼓勵(lì)回帖交流 2014-07-24 09:31:19
gyesang: 回帖置頂 2014-07-24 17:00:14
感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
hajierlove(西門吹雪170代發(fā)): 金幣+3, 鼓勵(lì)回帖交流 2014-07-24 09:31:19
gyesang: 回帖置頂 2014-07-24 17:00:14
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你說條帶是同一孔有250+750還是有的是250有的是750？膠圖片可以放上來看一下 通用引物一般距離連接點(diǎn)都有幾十個(gè)bp的距離，上下游加起來差個(gè)一兩百是可能的，750bp有可能是對的 做菌液pcr最好是用通用引物和你的引物混搭，比如用通用上游引物和你的基因片段下游引物，當(dāng)然這樣子會(huì)導(dǎo)致你得到的陽性克隆減少一半。因?yàn)檫@是定向pcr，如果你的ORF克隆到載體里面是反向的話不會(huì)被擴(kuò)增。但是應(yīng)該可以給你足夠多的陽性克隆了。換別的搭配也行，這樣子的話準(zhǔn)確性會(huì)高一些 |
9樓2014-07-24 03:38:57
luwei13566
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西門吹雪170: 金幣+2, 鼓勵(lì)回帖交流 2014-07-24 09:31:49
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西門吹雪170: 金幣+2, 鼓勵(lì)回帖交流 2014-07-24 09:31:49
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你的載體是哪個(gè)牌子的？如果是pMD19-T的話一般用M13通用引物的話除了你的目的基因在基因兩端會(huì)多擴(kuò)出150bp以上的一段載體片段，所以你的那個(gè)750bp的片段可能是對的，而你的那個(gè)250bp的片段可能擴(kuò)的是空載體。 拿你擴(kuò)增出750bp片段的菌再用你擴(kuò)基因的引物做個(gè)菌落PCR，或者直接提取質(zhì)粒雙酶切驗(yàn)證都可以，只要大小正確就可以去測序了。 |
5樓2014-07-23 22:37:42
lijianfu12
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凌波麗
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PCR擴(kuò)增后目的帶未出現(xiàn)而出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增帶（作者：凌波麗) 2013年11月8日 PCR擴(kuò)增后目的帶未出現(xiàn)而出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增帶，其原因與對策如下： I.引物的特異性差，受非特異性的PCR擴(kuò)增的競爭性抑制作用的影響，靶基因的PCR擴(kuò)增效率低，特異性的PCR產(chǎn)物極少�？赡艿木唧w原因和對策如下： 1.設(shè)立陽性和陰性對照，檢查反應(yīng)體系是否被污染。如果被污染則采用相應(yīng)的對策消除污染。具體見“二”。 2.加強(qiáng)DNA聚合酶的專一性。 （1）Taq DNA聚合酶的專一性擴(kuò)增不夠。改用專一性更強(qiáng)的DNA聚合酶，或者使用兩種不同的DNA聚合酶，減低酶量或調(diào)換另一來源的專一性高的酶。更換DNA聚合酶時(shí)，酶量不要太大，以免出現(xiàn)特異性擴(kuò)增。 （2）酶制劑中的甘油可能也是干擾因素。可以加入反應(yīng)體系之前用超濾去除酶制劑中的甘油。 （3）在反應(yīng)體系中加入：1.0mol/L的甜菜堿或者5%的DMSO可以提高PCR擴(kuò)增效率，兩者可以穩(wěn)定 DNA聚合酶。 3.縮短退火溫度時(shí)間或調(diào)高復(fù)性溫度。沒有重新設(shè)計(jì)引物，不要大范圍地變動(dòng)反應(yīng)體系的復(fù)性溫度，要在引物的Tm少5-10度的范圍內(nèi)變動(dòng)。如果出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增，則把在引物的Tm少5-10度的范圍內(nèi)把復(fù)性溫度提高1-3度；如果出現(xiàn)任何擴(kuò)增帶，則把在引物的Tm少5-10度的范圍內(nèi)把復(fù)性溫度降低1-3度。 4.采用使用專一性更強(qiáng)的梯度降低PCR、熱啟動(dòng)PCR和巢式PCR。 （1）使用梯度降低PCR。在以基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增時(shí)，非特異性擴(kuò)增較多，這時(shí)，最初的退火溫度選用比Tm高5-10度。然后每隔1個(gè)循環(huán)，退火溫度降低1-2度，直至到達(dá)正常的Tm附近的退火溫度。 （2）使用熱啟動(dòng)模式�？梢再徺I商用的PCR熱啟動(dòng)酶，也可以用石蠟隔離模式。 5.適當(dāng)減少DNA模板量和四中脫氧核苷酸的濃度也能夠一定程度上減少非特異性擴(kuò)增。 II.反應(yīng)體系被污染：這種污染有兩種原因： 1.整個(gè)基因組或大片段的交叉污染，導(dǎo)致非特異性帶出現(xiàn)。 這種非特異性帶出現(xiàn)可用以下方法解決： （1）在加樣槍的接頭和吸桿之間加上脫脂消毒棉花，防止將靶序列吸入加樣槍內(nèi)或?yàn)R出離心管外。 （2）除了酶及不能耐高溫的物質(zhì)外，所有試劑或器材均應(yīng)高壓消毒。 （3）所用離心管及樣進(jìn)槍頭等均應(yīng)一次性使用。必要時(shí)，在加標(biāo)本前，反應(yīng)管和試劑用紫外線照射，以破壞存在的核酸。 （4）重新提取模板DNA。 2.空氣中的小片段核酸污染，這些小片段比靶序列短，但有一定的同源性。有時(shí)候可能會(huì)互相拼接，與引物互補(bǔ)后，可擴(kuò)增出PCR產(chǎn)物，而導(dǎo)致非特異性帶出現(xiàn)的產(chǎn)生。雖然這樣的可能性比較小。 對策：實(shí)驗(yàn)前對實(shí)驗(yàn)室充分通風(fēng)，試驗(yàn)時(shí)盡量加上PCR試劑暴露于空氣中的時(shí)間，還可用巢式PCR方法來減輕或消除空氣中的小片段核酸造成的污染，最基本的解決辦法：重新提取模板DNA。 前面所有措施都不行，那就只好重新設(shè)引物了。本文是2013年11月8日重新編輯的。 |
6樓2014-07-24 00:51:26
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hajierlove
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10樓2014-07-24 03:45:14
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