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hajierlove銅蟲 (正式寫手)
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[求助]
菌液pcr,坐等求助 已有7人參與
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| 今天做的菌液pcr，三個基因挑了48個單克隆，做菌液pcr，引物是M13通用引物，出來的目的條帶都是250bp。750bp。目的片段是500bp。怎么回事？只能證明沒有連接上嗎？ |
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luwei13566
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5樓2014-07-23 22:37:42
凌波麗
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【答案】應(yīng)助回帖
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西門吹雪170: 金幣+5, MolEPI+1, 鼓勵回帖交流 2014-07-24 09:32:22
西門吹雪170: 金幣+5, MolEPI+1, 鼓勵回帖交流 2014-07-24 09:32:22
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個人意見，剛寫出來的，邊想邊寫，可能有錯，僅供參考。 菌液PCR的假陽性的原因和解決方法(凌波麗，2014年7月24日) 1.建議樓主做陰性對照，陽性對照，檢查是否存在污染。 2.假陽性可能的來源是未能和載體連接上的插入片段，這不相當(dāng)于普通PCR的模板提取的那一步，這步的關(guān)鍵可能是保證挑的細(xì)菌克隆的確都能保證是陽性克隆。 3.菌液PCR假陽性也可能是引物設(shè)計有問題，引起不專一性PCR擴增。 4.可以加強DNA聚合酶的專一性（這步和普通PCR相同）： （1）Taq DNA聚合酶的專一性擴增不夠。改用專一性更強的DNA聚合酶，或者使用兩種不同的DNA聚合酶，減低酶量或調(diào)換另一來源的專一性高的酶。更換DNA聚合酶時，酶量不要太大，以免出現(xiàn)特異性擴增。 （2）酶制劑中的甘油可能也是干擾因素�？梢约尤刖篜CR反應(yīng)體系之前用超濾去除酶制劑中的甘油。 （3）在反應(yīng)體系中加入：1.0mol/L的甜菜堿或者5%的DMSO可以提高PCR擴增效率，兩者可以穩(wěn)定 DNA聚合酶。 5.是否存在菌液PCR的反應(yīng)體系之外的DNA污染源 菌液PCR的反應(yīng)體系被污染：這種污染有兩種原因： 第一種可能：大片段的交叉污染，導(dǎo)致非特異性帶出現(xiàn)。 這種非特異性帶出現(xiàn)可用以下方法解決： （1）在加樣槍的接頭和吸桿之間加上脫脂消毒棉花，防止以前操作時將其他的DNA靶序列吸入加樣槍內(nèi)。 （2）除了酶及不能耐高溫的物質(zhì)外，所有試劑或器材均應(yīng)高壓消毒。 （3）所用離心管及樣進槍頭等均應(yīng)一次性使用。必要時，在加標(biāo)本前，反應(yīng)管和試劑用紫外線照射，以破壞存在的核酸。 第二種可能：空氣中的小片段核酸污染，這些小片段比靶序列短，但有一定的同源性。有時候可能會互相拼接，與引物互補后，可擴增出PCR產(chǎn)物，而導(dǎo)致非特異性帶出現(xiàn)的產(chǎn)生。雖然這樣的可能性比較小。 對策：實驗前對實驗室充分通風(fēng)，試驗時盡量加上PCR試劑暴露于空氣中的時間。 6.反應(yīng)體系過大，模板DNA和非模板DNA過多引起了非特異性擴增。 7.目的DNA模板可能本身存在某些問題，比如與一些蛋白質(zhì)發(fā)生了較牢固的結(jié)合（特異性或者非特異性）-----因為細(xì)菌也有類核，而這樣的結(jié)合在裂解細(xì)菌由于某些因素沒有去除，或者目的DNA模板的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)有某些問題。第7點只是我從細(xì)菌分子生物學(xué)角度做的猜測。第7條成為原因的可能性極小。 因為如果挑的陽性克隆沒有問題，同時PCR的引物也肯定能夠與目的模板互補的話，那么出現(xiàn)目的DNA擴增片段應(yīng)該不是問題，也可能有非特異性擴增存在，但是只有非特異性擴增的話，所以此時就要考慮什么原因阻止了目的DNA的擴增。 8.引物的特異性差，受非特異性的PCR擴增的競爭性抑制作用的影響，靶基因的PCR擴增效率低，特異性的PCR產(chǎn)物極少。第1條措施到第6條措施均無效，則必須考慮重新設(shè)計引物。 |
8樓2014-07-24 02:25:30
lijianfu12
銀蟲 (正式寫手)
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2樓2014-07-23 21:26:20
【答案】應(yīng)助回帖
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感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
hajierlove(西門吹雪170代發(fā)): 金幣+3, 鼓勵回帖交流 2014-07-24 09:31:19
gyesang: 回帖置頂 2014-07-24 17:00:14
感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
hajierlove(西門吹雪170代發(fā)): 金幣+3, 鼓勵回帖交流 2014-07-24 09:31:19
gyesang: 回帖置頂 2014-07-24 17:00:14
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你說條帶是同一孔有250+750還是有的是250有的是750？膠圖片可以放上來看一下 通用引物一般距離連接點都有幾十個bp的距離，上下游加起來差個一兩百是可能的，750bp有可能是對的 做菌液pcr最好是用通用引物和你的引物混搭，比如用通用上游引物和你的基因片段下游引物，當(dāng)然這樣子會導(dǎo)致你得到的陽性克隆減少一半。因為這是定向pcr，如果你的ORF克隆到載體里面是反向的話不會被擴增。但是應(yīng)該可以給你足夠多的陽性克隆了。換別的搭配也行，這樣子的話準(zhǔn)確性會高一些 |
9樓2014-07-24 03:38:57
胡亞梅
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3樓2014-07-23 21:40:31
4樓2014-07-23 22:23:16
凌波麗
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【答案】應(yīng)助回帖
感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
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PCR擴增后目的帶未出現(xiàn)而出現(xiàn)非特異性擴增帶（作者：凌波麗) 2013年11月8日 PCR擴增后目的帶未出現(xiàn)而出現(xiàn)非特異性擴增帶，其原因與對策如下： I.引物的特異性差，受非特異性的PCR擴增的競爭性抑制作用的影響，靶基因的PCR擴增效率低，特異性的PCR產(chǎn)物極少�？赡艿木唧w原因和對策如下： 1.設(shè)立陽性和陰性對照，檢查反應(yīng)體系是否被污染。如果被污染則采用相應(yīng)的對策消除污染。具體見“二”。 2.加強DNA聚合酶的專一性。 （1）Taq DNA聚合酶的專一性擴增不夠。改用專一性更強的DNA聚合酶，或者使用兩種不同的DNA聚合酶，減低酶量或調(diào)換另一來源的專一性高的酶。更換DNA聚合酶時，酶量不要太大，以免出現(xiàn)特異性擴增。 （2）酶制劑中的甘油可能也是干擾因素�？梢约尤敕磻�(yīng)體系之前用超濾去除酶制劑中的甘油。 （3）在反應(yīng)體系中加入：1.0mol/L的甜菜堿或者5%的DMSO可以提高PCR擴增效率，兩者可以穩(wěn)定 DNA聚合酶。 3.縮短退火溫度時間或調(diào)高復(fù)性溫度。沒有重新設(shè)計引物，不要大范圍地變動反應(yīng)體系的復(fù)性溫度，要在引物的Tm少5-10度的范圍內(nèi)變動。如果出現(xiàn)非特異性擴增，則把在引物的Tm少5-10度的范圍內(nèi)把復(fù)性溫度提高1-3度；如果出現(xiàn)任何擴增帶，則把在引物的Tm少5-10度的范圍內(nèi)把復(fù)性溫度降低1-3度。 4.采用使用專一性更強的梯度降低PCR、熱啟動PCR和巢式PCR。 （1）使用梯度降低PCR。在以基因組DNA為模板進行PCR擴增時，非特異性擴增較多，這時，最初的退火溫度選用比Tm高5-10度。然后每隔1個循環(huán)，退火溫度降低1-2度，直至到達(dá)正常的Tm附近的退火溫度。 （2）使用熱啟動模式�？梢再徺I商用的PCR熱啟動酶，也可以用石蠟隔離模式。 5.適當(dāng)減少DNA模板量和四中脫氧核苷酸的濃度也能夠一定程度上減少非特異性擴增。 II.反應(yīng)體系被污染：這種污染有兩種原因： 1.整個基因組或大片段的交叉污染，導(dǎo)致非特異性帶出現(xiàn)。 這種非特異性帶出現(xiàn)可用以下方法解決： （1）在加樣槍的接頭和吸桿之間加上脫脂消毒棉花，防止將靶序列吸入加樣槍內(nèi)或濺出離心管外。 （2）除了酶及不能耐高溫的物質(zhì)外，所有試劑或器材均應(yīng)高壓消毒。 （3）所用離心管及樣進槍頭等均應(yīng)一次性使用。必要時，在加標(biāo)本前，反應(yīng)管和試劑用紫外線照射，以破壞存在的核酸。 （4）重新提取模板DNA。 2.空氣中的小片段核酸污染，這些小片段比靶序列短，但有一定的同源性。有時候可能會互相拼接，與引物互補后，可擴增出PCR產(chǎn)物，而導(dǎo)致非特異性帶出現(xiàn)的產(chǎn)生。雖然這樣的可能性比較小。 對策：實驗前對實驗室充分通風(fēng)，試驗時盡量加上PCR試劑暴露于空氣中的時間，還可用巢式PCR方法來減輕或消除空氣中的小片段核酸造成的污染，最基本的解決辦法：重新提取模板DNA。 前面所有措施都不行，那就只好重新設(shè)引物了。本文是2013年11月8日重新編輯的。 |
6樓2014-07-24 00:51:26
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hajierlove
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10樓2014-07-24 03:45:14
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