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hajierlove銅蟲 (正式寫手)
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[求助]
菌液pcr,坐等求助 已有7人參與
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| 今天做的菌液pcr，三個(gè)基因挑了48個(gè)單克隆，做菌液pcr，引物是M13通用引物，出來(lái)的目的條帶都是250bp。750bp。目的片段是500bp。怎么回事？只能證明沒有連接上嗎？ |
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凌波麗
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【答案】應(yīng)助回帖
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西門吹雪170: 金幣+5, MolEPI+1, 鼓勵(lì)回帖交流 2014-07-24 09:32:22
西門吹雪170: 金幣+5, MolEPI+1, 鼓勵(lì)回帖交流 2014-07-24 09:32:22
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個(gè)人意見，剛寫出來(lái)的，邊想邊寫，可能有錯(cuò)，僅供參考。 菌液PCR的假陽(yáng)性的原因和解決方法(凌波麗，2014年7月24日) 1.建議樓主做陰性對(duì)照，陽(yáng)性對(duì)照，檢查是否存在污染。 2.假陽(yáng)性可能的來(lái)源是未能和載體連接上的插入片段，這不相當(dāng)于普通PCR的模板提取的那一步，這步的關(guān)鍵可能是保證挑的細(xì)菌克隆的確都能保證是陽(yáng)性克隆。 3.菌液PCR假陽(yáng)性也可能是引物設(shè)計(jì)有問題，引起不專一性PCR擴(kuò)增。 4.可以加強(qiáng)DNA聚合酶的專一性（這步和普通PCR相同）： （1）Taq DNA聚合酶的專一性擴(kuò)增不夠。改用專一性更強(qiáng)的DNA聚合酶，或者使用兩種不同的DNA聚合酶，減低酶量或調(diào)換另一來(lái)源的專一性高的酶。更換DNA聚合酶時(shí)，酶量不要太大，以免出現(xiàn)特異性擴(kuò)增。 （2）酶制劑中的甘油可能也是干擾因素。可以加入菌液PCR反應(yīng)體系之前用超濾去除酶制劑中的甘油。 （3）在反應(yīng)體系中加入：1.0mol/L的甜菜堿或者5%的DMSO可以提高PCR擴(kuò)增效率，兩者可以穩(wěn)定 DNA聚合酶。 5.是否存在菌液PCR的反應(yīng)體系之外的DNA污染源 菌液PCR的反應(yīng)體系被污染：這種污染有兩種原因： 第一種可能：大片段的交叉污染，導(dǎo)致非特異性帶出現(xiàn)。 這種非特異性帶出現(xiàn)可用以下方法解決： （1）在加樣槍的接頭和吸桿之間加上脫脂消毒棉花，防止以前操作時(shí)將其他的DNA靶序列吸入加樣槍內(nèi)。 （2）除了酶及不能耐高溫的物質(zhì)外，所有試劑或器材均應(yīng)高壓消毒。 （3）所用離心管及樣進(jìn)槍頭等均應(yīng)一次性使用。必要時(shí)，在加標(biāo)本前，反應(yīng)管和試劑用紫外線照射，以破壞存在的核酸。 第二種可能：空氣中的小片段核酸污染，這些小片段比靶序列短，但有一定的同源性。有時(shí)候可能會(huì)互相拼接，與引物互補(bǔ)后，可擴(kuò)增出PCR產(chǎn)物，而導(dǎo)致非特異性帶出現(xiàn)的產(chǎn)生。雖然這樣的可能性比較小。 對(duì)策：實(shí)驗(yàn)前對(duì)實(shí)驗(yàn)室充分通風(fēng)，試驗(yàn)時(shí)盡量加上PCR試劑暴露于空氣中的時(shí)間。 6.反應(yīng)體系過大，模板DNA和非模板DNA過多引起了非特異性擴(kuò)增。 7.目的DNA模板可能本身存在某些問題，比如與一些蛋白質(zhì)發(fā)生了較牢固的結(jié)合（特異性或者非特異性）-----因?yàn)榧?xì)菌也有類核，而這樣的結(jié)合在裂解細(xì)菌由于某些因素沒有去除，或者目的DNA模板的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)有某些問題。第7點(diǎn)只是我從細(xì)菌分子生物學(xué)角度做的猜測(cè)。第7條成為原因的可能性極小。 因?yàn)槿绻舻年?yáng)性克隆沒有問題，同時(shí)PCR的引物也肯定能夠與目的模板互補(bǔ)的話，那么出現(xiàn)目的DNA擴(kuò)增片段應(yīng)該不是問題，也可能有非特異性擴(kuò)增存在，但是只有非特異性擴(kuò)增的話，所以此時(shí)就要考慮什么原因阻止了目的DNA的擴(kuò)增。 8.引物的特異性差，受非特異性的PCR擴(kuò)增的競(jìng)爭(zhēng)性抑制作用的影響，靶基因的PCR擴(kuò)增效率低，特異性的PCR產(chǎn)物極少。第1條措施到第6條措施均無(wú)效，則必須考慮重新設(shè)計(jì)引物。 |
8樓2014-07-24 02:25:30
lijianfu12
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2樓2014-07-23 21:26:20
胡亞梅
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3樓2014-07-23 21:40:31
4樓2014-07-23 22:23:16
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