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zeroon木蟲 (正式寫手)
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[求助]
關(guān)于連接、轉(zhuǎn)化、挑取單克隆的問題 已有3人參與
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情況是這樣的。以puc19為載體，在其多克隆位點(diǎn)插入一個(gè)片段，轉(zhuǎn)化后挑取單克隆驗(yàn)證。在平板上挑取了將近100個(gè)單菌，才找到一個(gè)正確插入了外援片段的。有沒有方法能更快更好的選擇出來那些真正有插入片段的�。� 畢竟在連接的時(shí)候，多克隆位點(diǎn)那里會(huì)產(chǎn)生自連，到不是因?yàn)闆]有去磷酸化，因?yàn)槎嗫寺∥稽c(diǎn)雙酶切后去磷酸化也沒用啊，兩種酶切，一個(gè)是kpn1，另一個(gè)是xho1。 上面是第一個(gè)問題。 第二個(gè)問題是，挑出了一個(gè)單克隆，放小瓶培養(yǎng)后，送樣測序，結(jié)果返回的結(jié)果是 非單克隆現(xiàn)象。 也就是說，小瓶培養(yǎng)的菌里面有轉(zhuǎn)入puc19質(zhì)粒的，因?yàn)槎寄茉赼mp抗性培養(yǎng)基里生長�，F(xiàn)在沒法子，只好繼續(xù)在amp固體培養(yǎng)基篩選挑單菌了。問題來了，有沒有更簡單的方法快速挑出轉(zhuǎn)化子呢？ 第三個(gè)問題屬于延伸類，有沒有可能在轉(zhuǎn)化的時(shí)候，puc19和puc19+目的片段，這兩種質(zhì)粒一起轉(zhuǎn)入一個(gè)大腸桿菌中，這樣一個(gè)菌里面，有兩種質(zhì)粒，那這怎么樣都沒法挑出單克隆來了，對不對？ 問題不難，拜托各位大神了，小弟在此謝過了！ |
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第一個(gè)問題：雙酶切一般假陽性率很低的，載體雙酶切后回收切開的鏈狀載體，目的片段也是雙酶切，然后連接轉(zhuǎn)化，一般能在抗性平板上生長的絕大部分都是陽性克隆的，如果只是為了測序，建議使用TA克隆，要想快速篩的陽性克隆可以外加藍(lán)白斑篩選； 第二個(gè)問題：挑菌斑的時(shí)候絕對挑取單菌落，挑取不同菌斑避免交叉污染，一般不會(huì)出現(xiàn)非單克隆現(xiàn)象的，同樣的要快速挑出轉(zhuǎn)化子�？梢宰鏊{(lán)白斑篩選； 第三個(gè)問題：質(zhì)粒具有排異性，一般一個(gè)細(xì)菌細(xì)胞只能轉(zhuǎn)化一種質(zhì)粒，類似于受精過程，一個(gè)卵細(xì)胞只接受一個(gè)精子，當(dāng)然也有些專門用作轉(zhuǎn)化多個(gè)質(zhì)粒的工程質(zhì)粒和工程菌除外。 個(gè)人見解 |
2樓2015-04-01 17:57:48
781055707
木蟲 (著名寫手)
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一般一個(gè)培養(yǎng)皿跳10個(gè)就可以了，十個(gè)沒有就基本肯定沒連上，去磷酸化對你這個(gè)實(shí)驗(yàn)是可行的，什么是去磷酸化，就是讓質(zhì)粒的5端失效，質(zhì)粒的5失效了它就一定無法自連了。 2，用T載體連是最有效的，你的引物上帶了酶切位點(diǎn)，連上后直接切就行了。 3同上。 [ 發(fā)自手機(jī)版 http://www.gaoyang168.com/3g ] |
3樓2015-04-01 18:13:06
tsingo
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1：首先檢查你的酶是否失活，如果一個(gè)酶失活，目的片段肯定連接不上。 2：轉(zhuǎn)化的篩選有個(gè)比較笨的方法，就是菌落PCR，挑選單克隆為模板做PCR，這樣可以在短時(shí)間內(nèi)做大量的篩選。單個(gè)菌落只能挑一半，剩下的一半備用；PCR引物最好是載體上的，不然，當(dāng)你的目的片段基因與你使用的克隆菌株基因同源性比較高時(shí)，假陽性比較高。 |
4樓2015-04-02 09:40:53
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