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胡祥祥新蟲 (小有名氣)
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[求助]
如何電轉(zhuǎn)GS115 已有2人參與
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各位大神 ，我是新手，求指教。 我用的是ppic9k的質(zhì)粒載體與目的基因融合表達載體，然后倒入TOP10中，然后培養(yǎng)，雙酶切和測序都是對的，就是倒入到GS115這一步?jīng)]有做好，我想請問你們我哪里做錯了。 1、提取質(zhì)粒，每個EP管重復(fù)3次，含有質(zhì)粒的大腸菌液，所以DNA的濃度比較高。 2、線性化質(zhì)粒。做的是100ul的體系，酶切1.5小時，（SACI酶）然后取出3ul跑膠，與原來的相比跑的條帶比較靠前，證明了線性化完成。 3、將100ul的體系中加入300dd水和400ul 酚氯仿，劇烈震蕩1min，然后離心10min，然后取出上清液，加入到新的ep管中。加入400ul的異丙醇和40ul的醋酸鈉，在-20度靜置1.5小時。后，離心12000rpm/10min，有明顯的沉淀。到掉上清，加入1ml的70%乙醇，離心10min，到在超凈臺倒掉�？崭�30min。30min后加入10ul的無菌dd水，置于冰上待用。 4，感受態(tài)的制備，取GS115的單菌落，放到50ml的YPD，然后放在搖床30度，180rpm。24h后，取出2ml放入一個新到Y(jié)PD培養(yǎng)基。3h后，測量OD600=1，然后將YPD溶液倒入兩個滅菌好的塑料試管中，4000rpm/5min，倒掉上清,然后加入25ml的無菌dd水，重懸后，4000rpm/5min, 倒掉上清,然后加入15ml的無菌dd水，重懸后，4000rpm/5min,倒掉上清,然后加入10ml的無菌1M/L山梨醇，重懸后，4000rpm/5min,倒掉上清,加入700ul的山梨醇，將兩個試管混合后轉(zhuǎn)移到ep管中，放在冰上代用，（操作基本上在冰上進行）。 5電轉(zhuǎn) 取80ul的感受態(tài)與10ul的質(zhì)粒混合后，放在冰上預(yù)冷5min，然后立即點擊（電轉(zhuǎn)杯是1mm的，電壓是0.9KV。時間是5.4ms。）然后立即加入1ml的山梨醇�；旌虾筠D(zhuǎn)移到一個無菌的ep管中。30度不震蕩，2h，然后涂MD平板，（沒有加G148、和加G418的量分別是2mg/ml和 4mg/ml）3天后，沒有長出來，但是半個月后長出一些菌落，挑去一些菌落取培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)沒有目的的蛋白質(zhì)，求大神指教。。。。跪求�。。。� |
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【答案】應(yīng)助回帖
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有幾個建議： 1，第三部的線性化后純化其實可以省略，尤其是這一步如果殘存乙醇，對電導(dǎo)是非常不利，盡量蒸發(fā)時間久一點。然后你在加入10ul水重新溶解后，有沒有電泳確定里面一定收集到了你的DNA呢。樓主也沒有說感受態(tài)是取多少菌液，濃縮到最后 70ul。量不要太多，按操作手冊比例來制作轉(zhuǎn)化效率還是較高的。 2.我們電導(dǎo)一般取的壓力是1.5kv，電導(dǎo)之前電轉(zhuǎn)杯也一定要預(yù)冷，我們通常是直接放到電轉(zhuǎn)杯里預(yù)冷，然后再電轉(zhuǎn)，是電轉(zhuǎn)完了之后要立即加入山梨醇。 3.涂平板后，尤其是MD平板上5D內(nèi)沒有長出來的，后面的基本上不可信了。建議先只涂MD平板，然后再轉(zhuǎn)到低濃度G418. 樓主共勉~ |
2樓2015-06-04 09:59:01
380218013
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3樓2015-07-22 13:02:42
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4樓2015-07-23 20:44:30
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5樓2015-07-23 23:22:33
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