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七小艾新蟲 (小有名氣)
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[求助]
SDS-PAGE圖求分析 已有6人參與
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圖中是放線菌菌體破碎上清的SDS-PAGE圖，樣品最終是用來跑雙向的，所以為了減少蛋白降解提高蛋白溶出率，用了不同的細(xì)胞裂解方法和幾種不同的裂解液，結(jié)果如圖所示。 A/B/C/D所用裂解液：Tris-HCl 50mM pH7.4, protease inhibitor cocktail E:Tris-HCl 50mM pH7.4, protease inhibitor cocktail, 8M 尿素 F：Tris-HCl 50mM pH7.4, protease inhibitor cocktail， 7M尿素，2M硫脲 G：Tris-HCl 50mM pH7.4, protease inhibitor cocktail，2%SDS（終濃度，SDS細(xì)胞破碎后加，65℃處理10min） 細(xì)胞破碎方法：A渦旋振蕩，B超聲，CDEFG機械均質(zhì) 想請教高手幾個問題 1、用SDS處理后的樣品蛋白膠為什么會跑成這樣？上面大分子量的蛋白全沒了，下面糊成一片？做過不加SDS進行65℃處理，雖然蛋白有一定程度降解，但大分子量的蛋白條帶還是有的，說明不是高溫造成的結(jié)果。不知道樣品中過量的SDS對跑膠有沒有什么影響？ 2、尿素和硫脲對SDS-PAGE是不是也有影響？因為加了尿素和硫脲的樣品蛋白膠顏色反而不如不加的，但是蛋白濃度測定（Bradford法和BCA法都測過）結(jié)果顯示加了尿素和硫脲的蛋白濃度較高，是不是尿素和硫脲對Bradford法和BCA法都有干擾（硫脲對BCA有干擾是確定的）？ 3、蛋白膠每次跑出來下面小分子量部分都沒有清晰的條帶，而是糊成一片的，這是什么原因？ IMG_0578_副本.jpg |
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七小艾: 金幣+5, ★★★很有幫助 2015-04-20 16:29:06
七小艾: 金幣+5, ★★★很有幫助 2015-04-20 16:29:06
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1。樣品中過量的SDS會使蛋白分子帶負(fù)電荷，電泳速度可想而知~~，另外處理二維電泳蛋白樣品不需要加SDS。推薦裂解液：8M 尿素, 4% CHAPS, 1%IPG buffer, protease inhibitor cocktail 2.做一維的蛋白電泳樣品預(yù)處理的時候需要高溫水煮變性，尿素和硫脲會在高溫時候轉(zhuǎn)化成尿酸，但是不影響在二維電泳時候的效果。 3.一般二維電泳蛋白樣品都是全蛋白電泳，而細(xì)胞中本來小分子蛋白就很多，再加上還有部分大分子蛋白降解成小分子，模糊成一片很正常。其實不推薦用這種方法來做二維的預(yù)實驗。。。二維電泳蛋白樣品處理最怕的就是離子的干擾，把這個問題解決了，一般問題不大。。 |
8樓2015-04-12 14:53:25
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9樓2015-04-20 16:23:07
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