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關(guān)于原核表達(dá)后，WB條帶不單一的問題。請大神幫忙！ 已有2人參與
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最近好不容易表達(dá)出蛋白，進(jìn)入純化。載體用的pET-32a，有his標(biāo)簽，前幾天第一次搖了500ml，嘗試掛了ni柱。洗脫下來后跑了電泳。結(jié)果如下： 蛋白泳道從左到右依次是：1.M 2.破碎后蛋白上清原液 3.流穿 4.洗脫 5-10分別是20,50,100,200,500mM以及1M咪唑洗脫 maker 從上到下分別是116,66,45,35,25,18,14. 可以看到在50和100mM咪唑濃度時(shí)，我的蛋白有被大量洗脫下來。 然后在跑膠的同時(shí)，用his抗體做了WB，結(jié)果比較奇怪，也希望大家?guī)臀曳治鲆幌拢?br /> WB我是間隔泳道點(diǎn)樣的。M緊挨著是pET-32a空載的上清，然后間隔一個(gè)泳道為有我質(zhì)粒菌的上清。最后一道是第一圖的100mM咪唑洗脫。 考染的圖只看前六個(gè)泳道，第六泳道是第一圖的100mM咪唑洗脫跑的。 那么問題來了。his抗體雜出來?xiàng)l帶按理說比較單一。為何我的會(huì)在目的條帶附近出現(xiàn)三個(gè)條帶呢？是蛋白有降解？還是二硫鍵錯(cuò)配？ 請大神指導(dǎo)！感激不盡！ |
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2樓2015-04-24 09:07:00
lirol
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3樓2015-04-24 16:56:16
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zhixuec
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【答案】應(yīng)助回帖
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yejunhong: 金幣+10, ★★★很有幫助 2015-04-27 18:43:52
yejunhong: 金幣+10, ★★★很有幫助 2015-04-27 18:43:52
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做抗體的話還是要盡可能的純 所以建議你將100，250mM咪唑洗脫的再過一次鎳柱，保證夠純 我以前做抗體的時(shí)候常這么干（記住鎳柱孵育在4℃進(jìn)行，過柱時(shí)盡可能在冰上進(jìn)行） 否則你制備的抗體也不純，假如再用不純的抗體做western的話，那么你的圖會(huì)非常的難看，不要偷懶…… 即使很純的抗體也可能雜出非單一的條帶，因?yàn)榈鞍妆磉_(dá)存在修飾，如E.coli的外膜蛋白OmpA，能雜出3條帶 祝實(shí)驗(yàn)順利！ |
5樓2015-04-27 17:37:01
6樓2015-04-27 18:46:12
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