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[求助] 實(shí)時(shí)熒光定量PCR之標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作已有2人參與

新手做實(shí)時(shí)定量PCR，好多東西不懂，大家?guī)兔聪�，我是從�?biāo)準(zhǔn)曲線做起的，前面幾次都是做的10個(gè)濃度梯度，這一次做的樣分別是無菌水空白，180pg/uL的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品，1.8ng/uL的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品，但是每個(gè)實(shí)驗(yàn)一樣的情況：無論是水，還是標(biāo)準(zhǔn)品，不論濃度梯度，所有的CT都是25左右，根本沒有任何區(qū)別，這是為什么��？求指導(dǎo)

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實(shí)時(shí)熒光定量PCR之標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作-1

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實(shí)時(shí)熒光定量PCR之標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作-2

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實(shí)時(shí)熒光定量PCR之標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作-3

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實(shí)時(shí)熒光定量PCR之標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作-4

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實(shí)時(shí)熒光定量PCR之標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作-5

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1樓 2015-05-18 10:01:37

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love_st

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毋庸置疑，污染

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2樓2015-05-18 13:35:51

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2樓: Originally posted by love_st at 2015-05-18 13:35:51
毋庸置疑，污染

只是污染而已嗎？那為什么十個(gè)濃度梯度的標(biāo)準(zhǔn)品的CT也是一樣的，絲毫按照3個(gè)CT的差？

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3樓2015-05-18 20:20:57

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laplacegsau

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是不是引物不對(duì)，沒有擴(kuò)增目的片段。無菌水的Ct值其實(shí)是引物二聚體

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4樓2015-05-23 12:49:09

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erland21411

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myprayer: 金幣+1, 贈(zèng)人玫瑰，手有余香，分子生物期待您更多精彩。 2015-06-08 13:19:45

你的質(zhì)粒梯度稀釋的時(shí)候使用水稀釋的？我原來做cDNA梯度的時(shí)候用水稀釋會(huì)有很大誤差的。
另外用水做模板的陰性對(duì)照CT都在25那反應(yīng)體系肯定是有污染的，看你的熔點(diǎn)曲線，感覺還是有兩個(gè)峰，最好換引物。

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5樓2015-05-23 22:33:50

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引用回帖:

4樓: Originally posted by laplacegsau at 2015-05-23 12:49:09
是不是引物不對(duì)，沒有擴(kuò)增目的片段。無菌水的Ct值其實(shí)是引物二聚體

恩，驗(yàn)證過了，是引物的問題，已經(jīng)換過引物了，謝謝

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6樓2015-06-08 11:32:03

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5樓: Originally posted by erland21411 at 2015-05-23 22:33:50
你的質(zhì)粒梯度稀釋的時(shí)候使用水稀釋的？我原來做cDNA梯度的時(shí)候用水稀釋會(huì)有很大誤差的。
另外用水做模板的陰性對(duì)照CT都在25那反應(yīng)體系肯定是有污染的，看你的熔點(diǎn)曲線，感覺還是有兩個(gè)峰，最好換引物。

已經(jīng)換過引物了，但是有時(shí)結(jié)果也還會(huì)是那樣，時(shí)好時(shí)壞，想問下怎么能少點(diǎn)污染呢，具體操作方面？求指點(diǎn)

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7樓2015-06-08 11:33:43

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大頭妞妞

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6樓: Originally posted by 十分想念 at 2015-06-08 11:32:03
恩，驗(yàn)證過了，是引物的問題，已經(jīng)換過引物了，謝謝...

你好，我想請(qǐng)問一下，如果我的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品和水陰性對(duì)照樣品，跑出來的標(biāo)準(zhǔn)曲線看到有兩個(gè)峰就說明是我的引物有問題，是這樣嗎？為什么啊，可是我的引物用來做PCR特異性檢測(cè)，水作為陰性對(duì)照也沒擴(kuò)出條帶啊，可以解釋一下這是什么意思嗎

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8樓2017-03-13 21:49:40

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8樓: Originally posted by 大頭妞妞 at 2017-03-13 21:49:40
你好，我想請(qǐng)問一下，如果我的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品和水陰性對(duì)照樣品，跑出來的標(biāo)準(zhǔn)曲線看到有兩個(gè)峰就說明是我的引物有問題，是這樣嗎？為什么啊，可是我的引物用來做PCR特異性檢測(cè)，水作為陰性對(duì)照也沒擴(kuò)出條帶啊，可以解釋 ...

新手上路，請(qǐng)問樓主標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制必須構(gòu)建質(zhì)粒作為標(biāo)準(zhǔn)品嗎？
可以用提取的DNA直接割膠純化獲得嗎？

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9樓2018-01-11 19:26:56

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