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人于兩點(diǎn)銅蟲(chóng) (小有名氣)
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[求助]
DNA降解問(wèn)題（求解釋原因） 已有2人參與
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從sigma買(mǎi)的Deoxyribonucleic acid, low molecular weight from salmon sperm（脫氧核糖核酸，來(lái)自三文魚(yú)的精子）。這東西放在4度冰箱兩年了，現(xiàn)在發(fā)現(xiàn)用水溶DNA呈酸性，pH=4.這是不是說(shuō)明，這樣品降解了。那么降解后的DNA，A260/A280的值會(huì)怎么變化呢？最近實(shí)驗(yàn)老是不能重復(fù)，被老板罵，所以希望各位兄弟姐妹，踴躍發(fā)言，金幣絕對(duì)不會(huì)少的。 |
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luwei13566
木蟲(chóng) (正式寫(xiě)手)
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一般做雜交的封閉液是需要把魚(yú)精DNA給預(yù)處理的。直接拿DNA這東西做營(yíng)養(yǎng)源我還真沒(méi)做過(guò)，不清楚是否需要預(yù)處理。不過(guò)我感覺(jué)如果DNA做營(yíng)養(yǎng)物的話(huà)，對(duì)魚(yú)精DNA質(zhì)量要求不高。 1.一般細(xì)胞拿DNA做營(yíng)養(yǎng)物需要在體外將其降解為堿基、脫氧核糖、磷酸才能被細(xì)胞攝取入體內(nèi)。你添加的DNA再完整作為營(yíng)養(yǎng)物也必然會(huì)被外源核酸酶、磷脂酶給降解掉才能被吸收，這個(gè)過(guò)程中大量磷酸釋放出來(lái)，pH肯定是要下降的，因此有必要的話(huà)需要加入緩沖液維持培養(yǎng)基的pH。 2.你買(mǎi)的這個(gè)DNA是low molecular weight DNA，可能已經(jīng)預(yù)處理過(guò)了。pH 4左右可能就是其正常的pH值，直接用Tris buffer溶解就可以用了，整個(gè)培養(yǎng)基可以用Tris buffer 調(diào)一下pH試試看 |
人于兩點(diǎn)
7樓2015-06-09 14:48:10
luwei13566
木蟲(chóng) (正式寫(xiě)手)
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是以干粉的形式保存在冰箱里，中途也沒(méi)拆開(kāi)過(guò)嗎？ 1.我感覺(jué)應(yīng)該能用，溶在水中測(cè)得的pH也不一定是DNA降解導(dǎo)致的，因?yàn)楸旧順悠分械某煞直旧砭秃茈s，還有相當(dāng)量的蛋白，按照說(shuō)明書(shū)上寫(xiě)的，只要用50 mM Tris pH 8.0溶解了，A260/280在1.4左右應(yīng)該就能用。 2.這個(gè)東西后期還得超聲處理吧，后期還得抽提、煮沸一類(lèi)的。你要是不放心處理完可以跑個(gè)電泳檢測(cè)一下。只要DNA出現(xiàn)帶型應(yīng)該就沒(méi)啥問(wèn)題。 3.用這個(gè)做封閉嗎？本身雜交就得多做幾次，特別是前期還有預(yù)處理，可能對(duì)你的結(jié)果影響更直接。 |
» 本帖已獲得的紅花（最新10朵）
2樓2015-06-08 23:59:05
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3樓2015-06-09 10:25:07
【答案】應(yīng)助回帖
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感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
人于兩點(diǎn): 金幣+5, ★★★很有幫助 2015-06-09 12:06:15
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人于兩點(diǎn): 金幣+5, ★★★很有幫助 2015-06-09 12:06:15
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干粉一般用的時(shí)候再溶，長(zhǎng)期不用的放在低溫保存，所以在溶完之后，最好分裝一下。短期用的放4度木有問(wèn)題，其他的扔低溫保存。 你這放4度都兩年了，能用的可能性不大（我也是做DNA方面的，放4度兩周，我基本就不用了）。如果可以的話(huà)，直接換新的吧。 |
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4樓2015-06-09 10:49:00
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