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mtyx銀蟲(chóng) (小有名氣)
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[求助]
裂解液提蛋白 已有4人參與
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| 我用裂解液提蛋白，離心后，說(shuō)是取上清液，可是我離心后，不分層也沒(méi)有沉淀，我想問(wèn)一下是什么原因啊 |
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2樓2015-06-27 16:39:33
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3樓2015-06-27 17:59:43
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4樓2015-06-29 11:02:26
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5樓2015-06-29 14:40:37
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【答案】應(yīng)助回帖
★ ★
mtyx: 金幣+2, ★★★很有幫助 2015-06-30 08:46:59
mtyx: 金幣+2, ★★★很有幫助 2015-06-30 08:46:59
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后續(xù)做WB的話，這點(diǎn)細(xì)胞有點(diǎn)點(diǎn)少的樣子，建議用一小瓶長(zhǎng)滿的細(xì)胞或者一個(gè)皿的細(xì)胞量來(lái)提取細(xì)胞。如果細(xì)胞珍貴可以用6孔板，先將培養(yǎng)基棄掉，用PBS漂洗2~3次，加入200ul裂解液，或者直接加入1X上樣緩沖液，用細(xì)胞刮刮下細(xì)胞，吸入到1.5ml EP管中煮沸5min后進(jìn)行電泳。細(xì)胞較少的話導(dǎo)致蛋白濃度過(guò)低，有些低豐度的目的蛋白在做WB檢測(cè)時(shí)有可能檢測(cè)不到，導(dǎo)致白板。祝好~~~ |
6樓2015-06-29 16:29:06
曼舞流蘇
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7樓2015-06-30 15:21:20
yanjunyan
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8樓2015-06-30 16:00:38
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【答案】應(yīng)助回帖
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樓主理解的沒(méi)錯(cuò)，1X上樣緩沖液中含有SDS可以使細(xì)胞蛋白變性，后續(xù)煮沸時(shí)，高溫可使細(xì)胞破碎，使蛋白釋放出來(lái)，這種方法沒(méi)問(wèn)題，我自己這樣做過(guò)。如果懷疑蛋白提的不好，可以選擇用專(zhuān)門(mén)的試劑盒或者專(zhuān)門(mén)的裂解液。另外樓主做膜蛋白要選擇該蛋白表達(dá)豐度較高的細(xì)胞系進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，可以試試細(xì)胞量增多，裂解液體積減少，使蛋白濃度增大，可能會(huì)使目的蛋白濃度增大。不過(guò)一般蛋白提取問(wèn)題不大，另外一抗的選擇很重要，有的抗體是真心做不出來(lái)結(jié)果。祝好~~ |
9樓2015-06-30 20:37:15
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