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LeonardoChen金蟲 (小有名氣)
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[求助]
重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化后提的平板有很多菌落，但是菌落PCR 沒有結(jié)果。 已有3人參與
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重組質(zhì)粒PET28a，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌（BL21），涂布到平板，37℃，培養(yǎng)14h左右，單菌落數(shù)有很多然后隨機(jī)挑取10單菌落，加入50微升無菌水，煮沸40min，做菌落PCR，第一次pcr體系是：10微升buffer ，1微升Taq ，1微升dNTP MIX ，1微升T7引物 ，1微升T7Terminator ，86微升無菌水。分裝每管9微升，再加入1微升煮沸的菌液，進(jìn)行PCR，跑膠結(jié)果顯示有陽性克隆，但是測(cè)序結(jié)果顯示都是假陽性。 第二次嘗試用另一種方法：10微升buffer ，1微升Taq ，1微升dNTP MIX ，1微升T7Terminator ，1微升引物R（就是自己剛開始做克隆設(shè)計(jì)的引物） ，86微升無菌水。分裝每管9微升，再加入1微升煮沸的菌液，進(jìn)行PCR，跑膠結(jié)果顯示都沒有陽性克隆。 PCR反應(yīng)條件：95℃ 5min，Sample Text 72℃ 10min，4.0℃ pause 各位能不能幫我分析下，為什么單菌落那么多卻沒有陽性克隆，如果是實(shí)驗(yàn)操作的原因最可能會(huì)出現(xiàn)在哪一步？謝謝，不甚感激！ |
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高gaoeryang
銀蟲 (小有名氣)
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- 專業(yè): 生物化學(xué)
【答案】應(yīng)助回帖
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從你的描述來看，第一次用載體上引物進(jìn)行菌落PCR驗(yàn)證，出現(xiàn)陽性克隆，但測(cè)序不對(duì)；第二次用載體和片段的引物，未出現(xiàn)陽性克隆。 一般來講，質(zhì)粒轉(zhuǎn)BL21成功率很高，你得到了較多的轉(zhuǎn)化子，轉(zhuǎn)化應(yīng)該是沒有問題的。 可以繞過菌落PCR驗(yàn)證，選擇4~10個(gè)轉(zhuǎn)化子進(jìn)行酶切驗(yàn)證，因?yàn)榫銹CR假陽性較高 一定要菌落PCR的話用你的第二次方法，多挑點(diǎn)轉(zhuǎn)化子，一次做30個(gè)，嘿嘿 還有從你的描述上看你才做了一次轉(zhuǎn)化，也可以再重復(fù)一次看看 再給你個(gè)經(jīng)驗(yàn)，盡量挑取菌落小的克隆子，分散著挑別扎堆 這個(gè)都是模式化的操作，沒問題的，再試試唄 |
5樓2015-10-12 17:24:09
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myprayer: 金幣+1, 贈(zèng)人玫瑰，手有余香，分子生物期待您更多精彩。 2015-10-12 13:40:24
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你先測(cè)序看重組質(zhì)粒是否正確，有可能是載體自連 發(fā)自小木蟲Android客戶端 |
2樓2015-09-27 22:59:35
飛龍?jiān)谔?05
禁蟲 (初入文壇)
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myprayer: 金幣+1, 贈(zèng)人玫瑰，手有余香，分子生物期待您更多精彩。 2015-10-12 13:40:31
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3樓2015-10-12 13:19:54
4樓2015-10-12 14:01:02
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