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liuliqujing新蟲(chóng) (初入文壇)
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[求助]
長(zhǎng)片段PCR擴(kuò)增 已有2人參與
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| 大家好，想請(qǐng)教下：我做全長(zhǎng)克隆，分兩段分別設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增目的片段，先反轉(zhuǎn)為cDNA，再PCR。我的片段一段為4324bp，一段為2100bp，但是4324bp的一直擴(kuò)增不出來(lái)，引物二聚體挺亮。2100bp擴(kuò)增出來(lái)了，但特異性不好。我用的takara的PrimeScript II 1st Strand cDNA合成試劑盒合成cDNA，PCR用PrimeSTAR Max DNA Polymerase和LA Taq with GC Buffer 分別擴(kuò)增過(guò)，長(zhǎng)片段一直也擴(kuò)增不出來(lái)，我的PCR程序：98℃ 2min,(98℃ 10s, 60℃ 15s, 72℃ 5min)*35, 72℃ 5min。中途解鏈時(shí)間，退火溫度時(shí)間均延長(zhǎng)過(guò)，一直沒(méi)結(jié)果。引物是沒(méi)有問(wèn)題的，已檢查比對(duì)過(guò)。謝謝。 |
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2樓2015-11-01 21:48:52
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3樓2015-11-01 23:22:42
足下客
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4樓2015-11-02 08:45:28
上官寒武
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5樓2015-11-03 09:33:34
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