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[求助]
長片段PCR擴(kuò)增 已有2人參與
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| 大家好，想請教下：我做全長克隆，分兩段分別設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增目的片段，先反轉(zhuǎn)為cDNA，再PCR。我的片段一段為4324bp，一段為2100bp，但是4324bp的一直擴(kuò)增不出來，引物二聚體挺亮。2100bp擴(kuò)增出來了，但特異性不好。我用的takara的PrimeScript II 1st Strand cDNA合成試劑盒合成cDNA，PCR用PrimeSTAR Max DNA Polymerase和LA Taq with GC Buffer 分別擴(kuò)增過，長片段一直也擴(kuò)增不出來，我的PCR程序：98℃ 2min,(98℃ 10s, 60℃ 15s, 72℃ 5min)*35, 72℃ 5min。中途解鏈時間，退火溫度時間均延長過，一直沒結(jié)果。引物是沒有問題的，已檢查比對過。謝謝。 |
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