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| 求助重疊延伸PCR的基本原理和方法 |
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Tintin77
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感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
曲酒封琴: 金幣+200, ★★★★★最佳答案, 好有幫助啊，受益匪淺。。。。 2015-11-17 14:06:01
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重疊延伸PCR技術(shù)(gene splicing by overlap extension PCR,簡(jiǎn)稱(chēng)SOE PCR)由于采用具有互補(bǔ)末端的引物,使PCR產(chǎn)物形成了重疊鏈,從而在隨后的擴(kuò)增反應(yīng)中通過(guò)重疊鏈的延伸,將不同來(lái)源的擴(kuò)增片段重疊拼接起來(lái).此技術(shù)利用PCR技術(shù)能夠在體外進(jìn)行有效的基因重組,而且不需要內(nèi)切酶消化和連接酶處理,可利用這一技術(shù)很快獲得其它依靠限制性?xún)?nèi)切酶消化的方法難以得到的產(chǎn)物.重疊延伸PCR技術(shù)成功的關(guān)鍵是重疊互補(bǔ)引物的設(shè)計(jì).重疊延伸PCR在基因的定點(diǎn)突變、融合基因的構(gòu)建、長(zhǎng)片段基因的合成、基因敲除以及目的基因的擴(kuò)增等方面有其廣泛而獨(dú)特的應(yīng)用。 以下是重疊延伸PCR的原理及兩基因的引物設(shè)計(jì)： A基因： 上游（F1）與開(kāi)放閱讀框起始密碼子附近的序列相對(duì)應(yīng)，并在5 ’末端添加酶切位點(diǎn)和3個(gè)保護(hù)堿基；下游（R1）與A基因終止密碼子附近的序列及B基因5’末端起始密碼子附近的序列互補(bǔ)，并去除A基因的終止密碼子TAA B基因： 上游（F2）與A基因終止密碼子附近的序列及B基因5 ’端起始密碼子附近的序列相對(duì)應(yīng)，同樣去除A基因終止密碼子TAA；下游（R2）與B基因的開(kāi)放閱讀框終止密碼子序列互補(bǔ)，并在5’末端添加酶切位點(diǎn)和2個(gè)保護(hù)堿基。 先分別用F1、R1，F(xiàn)2、R2擴(kuò)增出A和B基因，然后再用F1和R2將兩基因連接起來(lái)，得到融合基因。 外定點(diǎn)突變技術(shù)是研究蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能之間的復(fù)雜關(guān)系的有力工具，也是我們?cè)趯?shí)驗(yàn)室中改造/優(yōu)化基因常用的手段。而采用重疊引物PCR介導(dǎo)的定點(diǎn)突變實(shí)驗(yàn)是一種快速有效的在基因中特定位點(diǎn)引入特定突變的有效技術(shù)。該技術(shù)采用具有互補(bǔ)末端的引物，使PCR產(chǎn)物形成了重疊鏈, 從而在隨后的擴(kuò)增反應(yīng)中通過(guò)重疊鏈的延伸，將不同來(lái)源的擴(kuò)增片段重疊拼接起來(lái)。此技術(shù)利用PCR技術(shù)能夠在體外進(jìn)行有效的基因重組，而且不需要內(nèi)切酶消化和連接酶處理，可利用這一技術(shù)很快獲得其它依靠限制性?xún)?nèi)切酶消化的方法難以得到的產(chǎn)物。該技術(shù)主要包括以下幾步：設(shè)計(jì)引物，PCR擴(kuò)增基因兩端，回收兩端片段，兩端片段退火延伸，擴(kuò)增全長(zhǎng)基因。 |
2樓2015-11-17 14:05:03
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。。。。。。 |
3樓2015-11-17 14:09:42
九品品
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4樓2016-10-22 11:21:09
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需要加兩端的上下游引物，兩個(gè)片段按比例添加1:1，其它pcr成分都需要添加，之后運(yùn)行PCR，回收長(zhǎng)片段 發(fā)自小木蟲(chóng)IOS客戶(hù)端 |
5樓2016-10-28 22:55:54
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