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| 求助重疊延伸PCR的基本原理和方法 |
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Tintin77
木蟲 (正式寫手)
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【答案】應助回帖
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感謝參與，應助指數(shù) +1
曲酒封琴: 金幣+200, ★★★★★最佳答案, 好有幫助啊，受益匪淺。。。。 2015-11-17 14:06:01
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重疊延伸PCR技術(shù)(gene splicing by overlap extension PCR,簡稱SOE PCR)由于采用具有互補末端的引物,使PCR產(chǎn)物形成了重疊鏈,從而在隨后的擴增反應中通過重疊鏈的延伸,將不同來源的擴增片段重疊拼接起來.此技術(shù)利用PCR技術(shù)能夠在體外進行有效的基因重組,而且不需要內(nèi)切酶消化和連接酶處理,可利用這一技術(shù)很快獲得其它依靠限制性內(nèi)切酶消化的方法難以得到的產(chǎn)物.重疊延伸PCR技術(shù)成功的關鍵是重疊互補引物的設計.重疊延伸PCR在基因的定點突變、融合基因的構(gòu)建、長片段基因的合成、基因敲除以及目的基因的擴增等方面有其廣泛而獨特的應用。 以下是重疊延伸PCR的原理及兩基因的引物設計： A基因： 上游（F1）與開放閱讀框起始密碼子附近的序列相對應，并在5 ’末端添加酶切位點和3個保護堿基；下游（R1）與A基因終止密碼子附近的序列及B基因5’末端起始密碼子附近的序列互補，并去除A基因的終止密碼子TAA B基因： 上游（F2）與A基因終止密碼子附近的序列及B基因5 ’端起始密碼子附近的序列相對應，同樣去除A基因終止密碼子TAA；下游（R2）與B基因的開放閱讀框終止密碼子序列互補，并在5’末端添加酶切位點和2個保護堿基。 先分別用F1、R1，F(xiàn)2、R2擴增出A和B基因，然后再用F1和R2將兩基因連接起來，得到融合基因。 外定點突變技術(shù)是研究蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能之間的復雜關系的有力工具，也是我們在實驗室中改造/優(yōu)化基因常用的手段。而采用重疊引物PCR介導的定點突變實驗是一種快速有效的在基因中特定位點引入特定突變的有效技術(shù)。該技術(shù)采用具有互補末端的引物，使PCR產(chǎn)物形成了重疊鏈, 從而在隨后的擴增反應中通過重疊鏈的延伸，將不同來源的擴增片段重疊拼接起來。此技術(shù)利用PCR技術(shù)能夠在體外進行有效的基因重組，而且不需要內(nèi)切酶消化和連接酶處理，可利用這一技術(shù)很快獲得其它依靠限制性內(nèi)切酶消化的方法難以得到的產(chǎn)物。該技術(shù)主要包括以下幾步：設計引物，PCR擴增基因兩端，回收兩端片段，兩端片段退火延伸，擴增全長基因。 |
2樓2015-11-17 14:05:03
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。。。。。。 |
3樓2015-11-17 14:09:42
4樓2016-10-22 11:21:09
Tintin77
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5樓2016-10-28 22:55:54
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