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新蟲 (初入文壇)

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[交流] 插入質(zhì)粒啟動(dòng)子下游的是DNA模板鏈還是編碼鏈？已有4人參與

各位大俠：
小弟菜鳥，被2個(gè)問題困得茶飯不思，懇請(qǐng)各位大俠鼎力相助：
1.構(gòu)建質(zhì)粒時(shí)，我們通用genebank上查到的mRNA序列插入質(zhì)粒，并置于啟動(dòng)子下端，進(jìn)行轉(zhuǎn)錄和翻譯表達(dá)。但這2天犯渾了，突然想，質(zhì)粒首先要將插入片段轉(zhuǎn)錄成mRNA（即跟genebank上查到的序列一致的序列），然后以mRNA為模板進(jìn)行翻譯。但轉(zhuǎn)錄都是以DNA模板鏈轉(zhuǎn)錄成mRNA,所以插入質(zhì)粒的序列應(yīng)該是mRNA互補(bǔ)的那條鏈，即模板鏈，而不是genebank上查到的mRNA序列，但我們通常都是將mRNA序列擴(kuò)增后插入，并置于啟動(dòng)子下，這是怎么回事？是不是我以前都做錯(cuò)了？一下糊涂了。再者，啟動(dòng)子是與RNA聚合酶結(jié)合的地方，從而啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄，故，啟動(dòng)子也應(yīng)位于模板鏈而不是位于編碼鏈，可啟動(dòng)子就是位于編碼基因5端上游，這是為何？徹底糊涂！
2.表達(dá)質(zhì)粒通常都有一個(gè)強(qiáng)有力地啟動(dòng)子并設(shè)計(jì)好了各種表達(dá)調(diào)控原件，以有利于基因轉(zhuǎn)錄與表達(dá)。但外源基因在經(jīng)啟動(dòng)子啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄成mRNA后，單鏈mRNA是不是就跟質(zhì)粒脫離了，從而在胞質(zhì)內(nèi)進(jìn)行翻譯，那這樣，質(zhì)粒那些表達(dá)調(diào)控原件又如何能調(diào)控mRNA的翻譯表達(dá)呢？越想越糊涂，望各位大俠不吝賜教！非常非常感謝大家！

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1樓 2015-12-09 19:35:11

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biostar2009

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至于第二個(gè)問題，這位朋友有基本概念混淆
gene expression往往只限于transcription這一步，所謂的promoter，一般情況下也就只能負(fù)責(zé)RNA polymerase進(jìn)行transcription
至于mRNA translation，那是另一個(gè)問題，其中需要的所謂cis-element，此時(shí)已經(jīng)不在DNA上了，就在RNA上。

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4樓2015-12-10 11:00:35

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lifechuteng

新蟲 (小有名氣)

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1.理論上，插入質(zhì)粒的是DNA序列而非mRNA序列，mRNA序列=編碼鏈（有義鏈）序列=反向互補(bǔ)后的模板鏈（反義鏈）序列。
2.表達(dá)調(diào)控原件通常的作用對(duì)象是啟動(dòng)子區(qū)域，調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄效率，跟mRNA是沒關(guān)系的。mRNA的作用主要是作為翻譯模板。

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2樓2015-12-10 09:19:11

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biostar2009

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這個(gè)朋友提的問題很有意思，很多人估計(jì)從未想過這是個(gè)什么問題。
分子生物學(xué)上說，轉(zhuǎn)錄的時(shí)候，RNA polymerase從promoter啟動(dòng)，以DNA模板的一條鏈作為模板，合成和模板互補(bǔ)配對(duì)的鏈即RNA產(chǎn)物，這條鏈于是叫做模板鏈。但是這個(gè)問題似乎沒有什么實(shí)際應(yīng)用價(jià)值，我們?cè)诳寺』�，做體外轉(zhuǎn)錄等等的時(shí)候，從genebank拿到一條序列，然后裝上酶切位點(diǎn)，唰唰插到質(zhì)粒的啟動(dòng)子下游就可以了，轉(zhuǎn)錄出來的自然就是genebank上顯示的那條序列。
直到我遇到一個(gè)問題，在做RNA體外轉(zhuǎn)錄的時(shí)候，當(dāng)需要精確計(jì)算RNA產(chǎn)物的大小，面對(duì)酶切得到的這樣一個(gè)模板，產(chǎn)生的RNA是什么呢？
eg：
5’-T7 promoter-XXXXXXXXTCTAGA-3‘
3‘-T7 promoter-XXXXXXXXAGATCT-5’
這樣一個(gè)產(chǎn)物大家都知道，轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物一定是GGG-XXXXXXXXTCTAGA
但是面對(duì)酶切產(chǎn)物，模板變成了
5’-T7 promoter-XXXXXXXXT-3‘
3‘-T7 promoter-XXXXXXXXAGATC-5’
RNA轉(zhuǎn)錄出來，是GGG-XXXXXXXXT？還是GGG-XXXXXXXXTCTAG？
或者為什么，我們把從genebank上拿來的序列，裝到載體的promoter下方，就一定轉(zhuǎn)錄出來我們插入的序列？
所以我們裝進(jìn)入的到底是什么序列？
這里面應(yīng)該是有一個(gè)約定俗成的問題，即，genebank上給出的是mRNA，是翻譯的模板，沒有問題。
但是我們以這條鏈得到的DNA，跟mRNA方向一致的那條鏈并非載體promoter的模板鏈，而是非模板鏈
也就是說，載體上的promoter，是以插入DNA的另一條鏈，也就是跟mRNA互補(bǔ)的那條鏈為模板進(jìn)行轉(zhuǎn)錄的
所以上面那個(gè)不平齊的模板，產(chǎn)生的ＲＮＡ應(yīng)該是GGG-XXXXXXXXTCTAG

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3樓2015-12-10 10:58:19

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xuanrufeng

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引用回帖:

3樓: Originally posted by biostar2009 at 2015-12-10 10:58:19
這個(gè)朋友提的問題很有意思，很多人估計(jì)從未想過這是個(gè)什么問題。
分子生物學(xué)上說，轉(zhuǎn)錄的時(shí)候，RNA polymerase從promoter啟動(dòng)，以DNA模板的一條鏈作為模板，合成和模板互補(bǔ)配對(duì)的鏈即RNA產(chǎn)物，這條鏈于是叫做模板鏈 ...

請(qǐng)問前輩
我們將目的片段加在T7啟動(dòng)子后面那么轉(zhuǎn)錄時(shí)是以下面3-5那條為模板的吧？那么轉(zhuǎn)錄是的就是以T7互補(bǔ)序列作為啟動(dòng)子了么？求解答
5’-T7 promoter（TAATACGACTCACTATA）-XXXXXXXXTCTAGA-3‘
3‘-T7 promoter（ATTATGCTGAGTGATAT）-XXXXXXXXAGATCT-5’

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本性難移

5樓2015-12-30 18:47:17

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