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gookies新蟲 (初入文壇)
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雙酶切很近的酶切位點，總是切不成功，如何解決？ 已有6人參與
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實驗需要將已有的載體進行雙酶切，再插入一段片段。 由于只能插入到多克隆位點上，所以酶切位點的選擇有限，只能選擇靠得很近的兩個酶切位點，序列是： GACGTCGGATCCGAATTCGGTACC 需要切的是GACGTC（Aat II）和GGTACC（Kpn I） 之前用的TAKARA的酶，由于Buffer不同，分步酶切，但是效率一直很低，得不到最終的雙酶切。 后來用NEB的酶，使用的是Aat II 和 Kpn I HF快切酶。 然后回收（回收濃度也非常低，0.004~0.015（ug/ul）之間），與目的片段連接。 由于插入片段的目的是為了破壞氨芐的抗性，同時載體本身具有卡納的抗性。 所以轉(zhuǎn)化之后，先用卡納平板篩選， 挑斑到卡納液體LB中，搖渾后再取部分在amp液體LB中培養(yǎng)，想著amp不渾濁的就是插入了片段的。 可是挑了幾十個斑，都是兩種抗性都有，隨機挑了兩個進行測序，發(fā)現(xiàn)目的片段壓根就沒有插入。 中間換了新酶切后的插入片段進行連接，仍然沒有成功。 又做了一次雙酶切，回收條帶也非常淺。 是要再多次做一下雙酶切嘛？（因為第一次有六個載體同時做雙酶切，但是又試了兩個進行連接，也都沒有連接上） 不知道有什么方法可以更好地進行雙酶切？ 求大神醍醐灌頂。。。 |
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