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一起來(lái)旅行銀蟲(chóng) (正式寫(xiě)手)
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PCR擴(kuò)增結(jié)果有9個(gè)突變位點(diǎn) 已有3人參與
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我用的是地方豬的背最長(zhǎng)肌的cDNA為模板，2?Taq MasterMix來(lái)擴(kuò)增的CDS區(qū)，目的片段1121bp，再連t載體最后菌液pcr后去測(cè)序，結(jié)果與ncbi上的原始序列比對(duì)后，發(fā)現(xiàn)了9個(gè)突變位點(diǎn)，是不是有點(diǎn)多��？ @biostar2009 @飛約瘋?cè)嗽?/u> @wizardfan @youlinglyw 發(fā)自小木蟲(chóng)Android客戶(hù)端 |
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yuhan131481
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西門(mén)吹雪170: 金幣+2, 鼓勵(lì)回帖交流 2016-11-11 07:16:47
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1. 用2×Q5PCRmix或者KAPA HIFI PCRmix擴(kuò)下試試，這兩種酶的保真性是taq酶的100倍。 2. 把DNA序列翻譯成氨基酸序列，比對(duì)下氨基酸序列，看看是不是同義突變。 3. 確定地方豬與文獻(xiàn)的來(lái)源一樣嗎，會(huì)不會(huì)本來(lái)基因就有一定的差異，只不過(guò)該基因代表的蛋白功能是相似的。就是蛋白結(jié)構(gòu)域是保守的，功能一樣，基因序列有細(xì)微差別。 |
4樓2016-11-09 18:06:03
didongwei
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9樓2016-11-11 14:15:46
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2樓2016-11-09 17:49:09
aliaaxmu2016
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要看原始測(cè)序圖AB1文件，就算他給你判讀為txt文件了，你也要看，假如在兩端有突變是不準(zhǔn)確的，你要重新設(shè)計(jì)引物重新測(cè)那一段(末端) 發(fā)自小木蟲(chóng)Android客戶(hù)端 |
3樓2016-11-09 17:59:31
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5樓2016-11-09 19:01:16
6樓2016-11-10 14:06:23
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| 不是相同樣品，如果基因也不是很保守的，序列有差異很正常。要排除就是選擇雙向測(cè)序，以及多測(cè)幾個(gè)樣本。上下兩條鏈測(cè)出來(lái)互補(bǔ)的，應(yīng)該就是測(cè)正確了，多次出現(xiàn)的，可以把偶然的突變看作的PCR造成的。測(cè)序結(jié)果做BLAST，找最相似的比對(duì)，不要只跟開(kāi)始選擇來(lái)參考的比對(duì)。跟最相似的序列還有差異的，翻譯看看出來(lái)的氨基酸是什么，通常亮氨酸，異亮氨酸，纈氨酸等相似氨基酸突變對(duì)蛋白功能影響不大，發(fā)生幾率很大的，可以推測(cè)是樣本來(lái)源的這種豬帶有的突變，其他的氨基酸也看看是不是變成相似的。一般對(duì)這樣的突變無(wú)需理會(huì)，如果是表達(dá)活性蛋白，就先表達(dá)測(cè)定看看也可以。 |
7樓2016-11-11 00:31:36
aliaaxmu2016
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建議重新設(shè)計(jì)引物再測(cè)一次，我這邊測(cè)長(zhǎng)片段都是分成好幾段測(cè)的，避免把某個(gè)前段放在邊緣測(cè)不準(zhǔn) 發(fā)自小木蟲(chóng)Android客戶(hù)端 |
8樓2016-11-11 08:01:32
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